題目：The gut microbiota promotes hepatic fatty acid desaturation and elongation in mice
多組學(xué)聯(lián)合分析研究腸道微生物群促進(jìn)小鼠肝臟脂肪酸去飽和和延長(zhǎng)
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
研究背景
哺乳動(dòng)物腸道具有高度復(fù)雜的腸道微生物群落，在過(guò)去的幾十年中，許多小鼠模型已被用于研究腸道微生物群及其與宿主的關(guān)系。本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，提出了腸道微生物對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響。
研究結(jié)果
1. 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析
作者針對(duì)無(wú)菌小鼠模型（GF）和無(wú)特定病原體小鼠模型（SPF）的肝臟和血漿樣品進(jìn)行多組學(xué)分析。其中，小鼠肝臟樣本的轉(zhuǎn)錄組使用微陣列芯片技術(shù)分析，總共分析了41174個(gè)探針，其中32308個(gè)可以定位到轉(zhuǎn)錄本，7769個(gè)探針顯著差異表達(dá)（3937個(gè)基因），GF和SPF之間的差異倍數(shù)最大達(dá)到14.3（圖1a）。通路富集分析揭示了GF小鼠中顯著富集的多個(gè)代謝通路，如藥物代謝、脂質(zhì)代謝（圖1b）。
使用TMT技術(shù)對(duì)小鼠肝臟樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)分析，共鑒定到5875個(gè)蛋白質(zhì)，GF和SPF中存在顯著差異的蛋白數(shù)目為455（圖1c），差異倍數(shù)最高達(dá)3.7。差異表達(dá)最顯著的蛋白質(zhì)分別為L3HYPDH、CYP3A11、EPHX1、ACSF2、SCD1，這幾個(gè)重要的蛋白質(zhì)均參與了特定的代謝過(guò)程，如亞油酸和視黃醇代謝（圖1d）。
作者使用基因名稱合并了蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以便識(shí)別在兩個(gè)組學(xué)層中上調(diào)或下調(diào)的基因。兩次組學(xué)同時(shí)鑒定到4843個(gè)基因（1i），其中2822個(gè)基因（約58％）為GF和SPF共有，984個(gè)基因在SPF中持續(xù)高表達(dá)（圖1e，Q2），1,838個(gè)基因在GF中持續(xù)高表達(dá)（圖1e，Q4）。蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組基因功能富集分析顯示SPF小鼠中上調(diào)的基因（Q2）在脂質(zhì)代謝中參與的8個(gè)GO生物過(guò)程中有5個(gè)表現(xiàn)出富集（圖1f），下調(diào)基因（Q4）則沒(méi)有顯著的GO注釋。作者發(fā)現(xiàn)，影響脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，如ACLY、FASN、SCD1和ELOVL6，在轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組中均存在差異表達(dá)。
圖1 SPF和GF小鼠肝臟樣品的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析
2. 磷酸化蛋白質(zhì)組分析
蛋白質(zhì)磷酸化在酶的活化和失活中起重要作用，因此，作者同時(shí)對(duì)GF和SPF小鼠的肝臟樣品進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組分析（磷酸化TMT）。在本次試驗(yàn)中，共鑒定到了5558種磷酸化肽段，其中1551個(gè)磷酸肽段，還可以檢測(cè)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組共同檢測(cè)到1527個(gè)磷酸肽段（圖1i）。作者研究發(fā)現(xiàn)363種蛋白質(zhì)在GF和SPF動(dòng)物之間具有顯著不同的磷酸化水平（圖1g），其中，8種蛋白參與到了脂質(zhì)代謝ACOT1、FASN、GPAM、LPIN1 / 2、PGRMC2、PLIN3和SLCO1A4。
3. 脂質(zhì)組學(xué)分析
為了檢測(cè)脂肪酸和脂質(zhì)代謝中涉及的酶的變化是否導(dǎo)致GF小鼠中的脂質(zhì)水平改變，作者進(jìn)行了全面的定量脂質(zhì)組分析。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)共檢測(cè)到血漿與肝臟樣本中的20類525種脂質(zhì)，如脂肪酸（FAs）、甘油磷脂、鞘脂和甾醇等。作者研究發(fā)現(xiàn)肝臟樣本中的16種脂質(zhì)在GF和SPF小鼠之間差異顯著，血漿樣本中則15種脂質(zhì)差異顯著。最重要的是，作者發(fā)現(xiàn)SPF和GF小鼠之間存在從單不飽和脂質(zhì)向多不飽和脂質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。SPF小鼠樣品中的棕櫚油酸和含有單不飽和酰基鏈的甘油磷脂，含量高出1.5倍（圖2a-d），而在GF小鼠中，多不飽和脂肪酸和甘油磷脂（如花生四烯酸）的含量較高。磷脂酰膽堿（PC，37％）、磷脂酰乙醇胺（PE，19％）、游離膽固醇（FC，11％）是肝臟中的主要脂質(zhì)類別（圖2e），鞘脂僅代表肝臟脂質(zhì)的一小部分，約占2%（圖2f）。血漿脂質(zhì)則以磷脂酰膽堿（PC，27％）、膽固醇酯（CE，54％）和游離膽固醇（FC，10％）為主（圖2g），而且肝臟和血漿樣品中每種脂質(zhì)類別的總濃度沒(méi)有差異（圖2e，g）。
總而言之，作者認(rèn)為以上數(shù)據(jù)顯示腸道微生物群影響肝臟和血漿中的特定脂肪酸和甘油磷脂物種譜。含有腸道微生物群的小鼠會(huì)較高比例的含有單不飽和脂肪酸（MUFA），而GF小鼠以脂質(zhì)飽和脂肪酸（SAFA） 和多不飽和脂肪酸（PUFA）為主。
圖2 GF和SPF小鼠肝臟和血漿的定量脂質(zhì)組分析
4. 組學(xué)數(shù)據(jù)重建脂肪酸代謝
作者假設(shè)GF小鼠的脂肪酸飽和度和延伸能力與SPF小鼠不同，導(dǎo)致肝臟甘油磷脂酰基鏈譜改變。因此，作者重建了脂肪酸代謝途徑并整合了磷酸化蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組，系統(tǒng)地概述肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程（圖3a，b）。作者在3個(gè)特定的脂肪酸轉(zhuǎn)化步驟中觀察到GF和SPF小鼠之間的顯著差異：（I）借助ACAC A / B和FASN，從乙酰-CoA從頭合成脂肪酸的過(guò)程（圖3a）; （II）通過(guò)SCD1將棕櫚酸酯（FA16:0）去飽和為棕櫚油酸酯（FA16:1 n-7）（圖3a）; （III）通過(guò)ELOVL5（圖4b）將FA18:3 n-6延伸至FA20:3 n-6（圖3b）。在所有步驟中，SPF具有較高值。為了支持（II）和（III），作者將脂肪酸產(chǎn)物/前體比率與相應(yīng)的mRNA或蛋白質(zhì)豐度相關(guān)聯(lián)。如圖 3d所示 ，SCD1表達(dá)與16：1 n -7 / FA16：0比率（mRNA： R ?= 0.93; p ?<0.00002;蛋白質(zhì)：R ?= 0.94; p ?<0.00005）強(qiáng)相關(guān)，ELOVL5表達(dá)與20：3 n -6/18：3 n -6的比率（mRNA： R ?= 0.79; p?<0.002; 蛋白質(zhì)：未檢測(cè)到）強(qiáng)相關(guān)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)脂肪酸部分的反應(yīng)比（產(chǎn)物/前體水平）與PC和LPC物種的相應(yīng)去飽和度和伸長(zhǎng)指數(shù)高度相關(guān)（圖3e），表明改變的FA代謝過(guò)程清楚地反映在酰基中。
圖3 多組學(xué)數(shù)據(jù)重建脂肪酸代謝途徑
5. 基于脂肪酸譜的綜合分類
為了獲得腸道微生物群特異性調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過(guò)程的進(jìn)一步證據(jù)，作者利用短期抗生素（氨芐青霉素（A）、萬(wàn)古霉素（V）、甲硝唑（M）、或萬(wàn)古霉素（V）和甲硝唑（M）的組合）處理SPF的腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，GC-MS定量肝臟脂肪酸譜，作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)FA 16:0、FA 20:3 n-6、FA 20:4 n-6和FA 22:6 n-3進(jìn)行分類，既能清楚地將GF與SPF小鼠區(qū)分開(kāi)（圖4a，b），也可將不同抗生素處理與未處理的小鼠區(qū)分開(kāi)（圖4c）。Scd1和Elovl5的mRNA表達(dá)水平明顯遵循分類評(píng)分的趨勢(shì)，低評(píng)分樣本有低表達(dá)水平（圖4d）。這些結(jié)果支持了腸道微生物群影響脂肪酸代謝代謝，特別是由SCD1和ELOVL5產(chǎn)生的脂肪酸（圖3a，b；反應(yīng)II和III）。
圖4抗生素對(duì)腸道微生物種類的影響
6. 腸道微生物群組成分析
為了確定抗生素對(duì)腸道微生物群多樣性和組成的影響，作者通過(guò)高通量測(cè)序分析了16S rRNA基因的V3-V4擴(kuò)增子。本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)總到376071個(gè)序列，代表172個(gè)OTU（每個(gè)樣品99±49 OTU）。所有抗生素均影響α多樣性（圖4e，f），與單獨(dú)的M相比，V和VM的組合具有特別顯著的影響，β多樣性分析揭示了V和VM樣品的顯著聚集，這些樣品與對(duì)照組分開(kāi)，但是彼此并不分離（圖4g），受抗生素影響最大的OUT來(lái)自于厚壁菌和擬桿菌。
文章小結(jié)
宿主的腸道微生物與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間的相互作用，與宿主的生理學(xué)機(jī)能和代謝疾病高度相關(guān)。本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，提出了腸道微生物促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝的多組學(xué)觀點(diǎn)。微生物可以通過(guò)硬脂酰輔酶A脫氫酶1（SCD1）誘導(dǎo)單不飽和脂肪酸生成，并通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶5誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸延伸，導(dǎo)致甘油磷脂酰基鏈分布的顯著改變。
解析文獻(xiàn)
Alida Kindt, Gerhard Liebisch, et al. The gut microbiota promotes hepatic fatty acid desaturation and elongation in mice. Nature Communications, 2018, DOI: 10.1038/s41467-018-05767-4
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