JIPB(IF=9.3)！中科院昆明植物所研究團隊首次破解四種野生樹莓基因組！

研究背景

以覆盆子（R.idaeus）為代表的栽培樹莓，因其果實富含抗癌活性的花青素、鞣花單寧等多酚，成為食藥兩用的明星作物。而野生近緣種如庫頁懸鉤子（R.sachalinensis）與覆盆子的分類爭議、西南特色野生種橢圓懸鉤子（R.ellipticus）和紅藨刺藤（R.niveus）的無刺栽培推廣，均因基因組數(shù)據(jù)匱乏限制了其分子機制研究。本研究通過多組學(xué)整合，首次完成4種野生樹莓的染色體級基因組組裝，并基于125個種質(zhì)的重測序數(shù)據(jù)系統(tǒng)解析屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，揭示中國野生樹莓在起源、進化及果實品質(zhì)調(diào)控中的核心價值，為抗逆育種與功能品種改良提供關(guān)鍵靶點。

研究結(jié)果

1、四種樹莓屬植物基因組組裝及比較基因組學(xué)研究

本研究首次完成了四種野生樹莓（R.idaeus、R.sachalinensis、R.ellipticus和R.niveus）的高質(zhì)量基因組組裝，各基因組組裝和注釋詳見表1。對于基因組組裝質(zhì)量，其組裝序列中超過99.7%被錨定到偽染色體上，scaffold N50值高達33.86-40.79 Mb（圖1A）。其中，R.ellipticus實現(xiàn)了無缺口的完整組裝，其他三種物種的基因組僅含2-3個缺口（表1）。對于基因組的共線性與完整性，四物種組裝的（亞）基因組與已發(fā)布的R.occidentalis、R.idaeus “Anitra”、R.chingii和R.corchorifolius基因組高度共線（圖1B），且通過BUSCO評估，證明其基因組質(zhì)量優(yōu)異（表1）。此外，透過泛基因組與核心基因組分析，平均約64.0%的基因家族構(gòu)成了核心基因組（圖1D），四種物種分別擁有358-518個物種特異基因家族（圖1E），主要富集于植物生長發(fā)育相關(guān)功能。

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹，懸鉤子屬（Rubus）位于薔薇亞科內(nèi)，是薔薇屬（Rosa）、草莓屬（Fragaria）和委陵菜屬（Potentilla）合并分支的姐妹分支（圖1F）?；贑AFE v3.0分析，R.ellipticus和R.niveus在懸鉤子屬進化中表現(xiàn)出顯著的基因家族擴張（圖1F）。擴張基因家族主要富集于生物合成和代謝過程，包括黃酮類和萜類相關(guān)通路，這可能與其果實的高營養(yǎng)價值和藥用成分相關(guān)。

表1 四種中國樹莓的基因組組裝和注釋

圖1 樹莓的比較基因組學(xué)和進化基因組學(xué)

2、高度雜合樹莓的亞基因組分型與進化

利用SubPhaser v1.24，成功實現(xiàn)R. idaeus（Ili）和R. sachalinensis兩種樹莓的亞基因組分型，發(fā)現(xiàn)亞基因組A或B特異k-mer主要富集于著絲粒區(qū)域，其著絲粒序列特征可作為亞基因組分配的潛在標記（圖2A-B）。此外，兩物種對應(yīng)的亞基因組在七條染色體上共享著大量古代基因組成分（I or i），LTR-RTs插入時間差異，揭示著不同進化起源，暗示著二者共同祖先可能曾發(fā)生過古同倍體雜交事件（圖2C）。

為探究亞基因組起源與進化關(guān)系，以Fragaria vesca為外類群，從八個懸鉤子物種中提取9,102個直系同源群（圖2D）。通過拼接各染色體同源基因構(gòu)建的七條染色體系統(tǒng)發(fā)育樹顯示五種拓撲類型：染色體1/4、2/6關(guān)系一致，3/5/7獨立演化；亞基因組B與栽培種“Anitra”高度關(guān)聯(lián)（除chr7外）。

基于單拷貝基因構(gòu)建的9,102棵基因樹揭示了“Anitra”與Ili/sachalinensis間的三種拓撲結(jié)構(gòu)，并映射至兩物種的七條染色體（圖2E）?；驑溆成滹@示：染色體6高度保守（反映功能約束），其余染色體重組頻率差異顯著；拓撲結(jié)構(gòu)2（“Anitra”與Ili亞基因組B聚類）主導(dǎo)多數(shù)染色體（chr3/7除外）（圖2E），與染色體系統(tǒng)發(fā)育模式一致（圖2D）。綜合基因組證據(jù)表明，兩物種為漸滲姐妹群，野生與栽培種間存在不完全譜系分選（ILS）事件，結(jié)合分子與表型特征，可將R. sachalinensis歸為R. idaeus亞種。

圖2 雜合二倍體樹莓的亞基因組分期與進化

3、中國懸鉤子屬與覆盆子的復(fù)雜進化情景

收集約80個懸鉤子屬物種以及17個全球分布的Rubus idaeus樣本進行葉綠體與核基因組的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)分析（圖3A）。主要結(jié)果如下：①存在著五個主要分支（Clades I-V），且主要譜系的葉綠體與核基因組拓撲結(jié)構(gòu)基本一致。②R.chamaemorus在核與葉綠體系統(tǒng)發(fā)育中均表現(xiàn)出古老分化，其雌雄異株特性使其與其他亞屬差異顯著。③亞屬Malachobatus（Clade III）為單系群，而亞屬Chamaebatus、Cylaetis和Dalibardetrum的物種則在其間穿插分布，表明這些亞屬間存在密切親緣關(guān)系。④最大的亞屬Idaeobatus在兩種系統(tǒng)發(fā)育樹中均呈現(xiàn)多系性，并分為三個明顯分支（Clades I，II，IV）。

此外，透過SplitsTree網(wǎng)絡(luò)分析，不僅確認了Clade I的兩個譜系，還識別出多個混源基因型，這些基因型代表了近期雜交事件，表明地理隔離雖維持了亞洲與西方基因庫的差異，但頻繁基因流動導(dǎo)致了覆盆子復(fù)合群的網(wǎng)狀進化（圖3B）。另外，ADMIXTURE分析也揭示了地理上分散的栽培品種間的共享祖先成分，尤其在“Bonus-henricus”、“Cascade Bounty”和“Polka”中表現(xiàn)明顯，反映了復(fù)雜的育種歷史（圖3C）。其中，對于“Bonus-henricus”，通過Dsuite分析可知，它是歷史上覆盆子兩個主要進化譜系間基因流動的關(guān)鍵橋梁，其基因型在兩種方法中均得到一致支持（圖3D）。綜上，這些發(fā)現(xiàn)共同凸顯了自然進化過程與人為因素是如何共同影響了現(xiàn)代覆盆子的遺傳多樣性。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育基因組不一致與雜交

4、著絲粒序列作為追溯雜交起源的進化指紋

著絲粒獨特的結(jié)構(gòu)組織可能在雜交事件中有效防止著絲粒序列同源化，從而保留雜交基因組中各自特有的祖先序列特征。對于著絲粒序列特征，本研究核心內(nèi)容如下：①通過CentIER與Hi-C數(shù)據(jù)整合，發(fā)現(xiàn)五種懸鉤子物種的著絲粒位置高度保守（圖4A），且顯著富集Gypsy/Athila（LTR-RTs）等重復(fù)元件（圖4B）。②對著絲粒LTRs的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，著絲粒特異性衛(wèi)星DNA的組織在親緣物種中保持著保守特征，在進化過程中發(fā)展出獨特的物種特異性重復(fù)模式（圖4C）。③不同懸鉤子物種的衛(wèi)星重復(fù)單元存在差異性富集，其中317 TRAs主要在R.niveus中積累，而在R.ellipticus中則為中等豐度（圖4D）。④比對不同樣本至R.idaeus（Ili）基因組，可以看出，北美與歐洲栽培品種在七條染色體上以i（B亞基因組）成分為主導(dǎo)，表明其共享單一祖先譜系。相比之下，中國野生種質(zhì)在著絲粒區(qū)域同時保留了I與i成分（如“Cascade Bounty”），其遺傳多樣性遠高于現(xiàn)代栽培品種，且后者遺傳基礎(chǔ)狹窄，亟需野生資源補充?？傮w而言，分析著絲粒多樣性為理解基因組進化提供了新視角，并支持了野生種質(zhì)在作物改良中的有效利用。

圖4 覆盆子的著絲粒特性

5、樹莓果實成熟過程的代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析

為探究樹莓的營養(yǎng)特征分子基礎(chǔ)，通過廣泛靶標代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)R.ellipticus、R.niveus和R.sachalinensis樹莓在果實成熟三個關(guān)鍵階段（YF、MF1、MF2）中，MF1階段的代謝重編程最為劇烈，表現(xiàn)為差異積累代謝物（DAMs）和差異表達基因（DEGs）數(shù)量顯著增加，可能驅(qū)動著果實品質(zhì)特征的建立（圖5A）。在代謝物積累方面，三個物種在果實成熟過程中代謝物積累呈現(xiàn)明顯差異：藥用化合物（如類黃酮、酚酸、萜類、生物堿）隨成熟逐漸減少，而營養(yǎng)代謝物（如花青素、糖類、氨基酸）則逐漸增加。這種“防御-營養(yǎng)”轉(zhuǎn)換模式反映了果實發(fā)育的生態(tài)適應(yīng)性策略。

6、影響覆盆子果實著色的代謝物和基因

花青素和類胡蘿卜素是樹莓果實著色的主要色素，在R.ellipticus、R.niveus和R.sachalinensis中，成熟果實的主要花青素為矢車菊素或其糖苷衍生物（圖5B）。其中，R.sachalinensis成熟果實以矢車菊素和金絲桃苷為主，多樣性最高；R.niveus以飛燕草素為主，呈現(xiàn)深紫色；R.ellipticus則特異性積累葉黃素和蝦青素，這可能與黃色表型直接相關(guān)。值得注意的是，R.ellipticus盡管成熟時呈現(xiàn)黃色表型，但其果實中仍檢測到大量花青素（圖5B），表明其黃色并非由于花青素合成途徑受阻，而是與花青素運輸缺陷相關(guān)，具體表現(xiàn)為關(guān)鍵基因RelGST在成熟果實中表達顯著下調(diào)（圖5C）；相反地，當(dāng)瞬時過表達35S::RelGST后，其轉(zhuǎn)錄水平較野生型高34,195.3倍（圖5F），果實顏色顯著加深（圖5E），主要花青素含量顯著提升（圖5G）。

此外，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定了與功能已知花青素轉(zhuǎn)運蛋白同源的GST基因（如RsaGST1、RniGST、RelGST）。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）也揭示了RelGST表達與花青素合成結(jié)構(gòu)基因（如RelCHS、RelUFGT）及調(diào)控基因（如RelMYB、RelbHLH）的顯著正相關(guān)（圖5D），該結(jié)果也得到qRT-PCR數(shù)據(jù)的進一步支持。

圖5 R.ellipticus，R.niveus，和R.sachalinensis的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

研究小結(jié)

本研究通過組裝四種野生樹莓物種的近完整染色體尺度參考基因組，揭示了其進化歷史與果實品質(zhì)調(diào)控機制。泛基因組資源表明，懸鉤子屬中類黃酮/萜類代謝通路的擴展與果實生物活性化合物多樣性密切相關(guān)。值得注意的是，著絲粒序列特征可作為亞基因組標記和進化指紋，用于追溯覆盆子的雜交起源。對125份種質(zhì)資源的群體基因組分析發(fā)現(xiàn)，覆盆子中存在廣泛的基因滲入事件，其著絲粒單倍型特征揭示了栽培品種的祖先貢獻。通過整合代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)，鑒定了樹莓果實生物活性化合物合成的關(guān)鍵基因與代謝物。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，R.ellipticus的黃色表型源于GST基因介導(dǎo)的花青素運輸缺陷。本研究深化了對中國樹莓物種復(fù)雜進化模式的理解，所生成的大規(guī)模多組學(xué)數(shù)據(jù)為優(yōu)質(zhì)樹莓育種提供了重要資源。