英文標題：Fatty Acid Oxidation-Glycolysis Metabolic Transition Affects ECM Homeostasis in Silica-Induced Pulmonary Fibrosis

中文標題：脂肪酸氧化-糖酵解代謝轉換影響二氧化硅誘導的肺纖維化中細胞外基質穩態

發表期刊：Advanced Science

影響因子：14.3

客戶單位：南京醫科大學

百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2

肺纖維化是慢性致命性疾病，長期接觸二氧化硅粉塵可引發硅肺，是常見且嚴重的職業病，給個人和社會帶來沉重負擔。纖維化以成肌纖維細胞異常增殖和細胞外基質(Exracellular Matrix, ECM)過度產生為特征。代謝重編程在肺纖維化中起重要作用，糖酵解和脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation, FAO)代謝紊亂可能影響ECM的平衡，但具體機制不明。本研究旨在探究其機制，并評估針對調控相關代謝途徑和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的治療潛力。

1、小鼠肺纖維化的發生伴隨著細胞代謝的重構

為分析二氧化硅刺激后的細胞代謝狀態，構建經氣管內單次滴注二氧化硅懸液的小鼠模型，于暴露后7天、14天、28天收集肺組織。H&E染色結果（圖1A）顯示，隨硅肺進展，肺部炎癥和纖維化程度逐漸加重。羥脯氨酸測定表明，肺組織膠原水平隨二氧化硅暴露時間延長顯著升高（圖1B）。在硅肺進展過程中，細胞外基質成分（如纖維連接蛋白、膠原蛋白 I、彈性蛋白）的蛋白質水平通過Western blot檢測呈時間依賴性增加（圖1C）。為進一步明確膠原沉積形式，對肺組織病理切片進行Masson染色、天狼星紅染色及偏振光成像，結果顯示纖維化肺組織中膠原纖維大量沉積，結構紊亂且以不溶性膠原為主（圖1D）。

為深入探究代謝重構機制，進一步開展轉錄組和代謝組分析。代謝組學分析（圖1E）顯示，肺纖維化小鼠肺組織中糖酵解中間產物（如3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸）含量顯著增加，而FAO相關代謝物（如3-羥基丁酸、L-肉堿、硬脂酰肉堿）水平降低，提示糖酵解增強、FAO 減弱的代謝表型。Western blot檢測（圖1F）進一步證實，糖酵解關鍵蛋白（HIF-1α、己糖激酶2(HK2)、葡萄糖轉運蛋白3(GLUT3)、磷酸果糖激酶2(PFK2)）表達上調，而FAO調控蛋白（肉堿棕櫚酰轉移酶1a(CPT1a)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、PPAR-α水平顯著下降，與轉錄組和代謝組結果一致。

2、活化的成纖維細胞通過糖酵解和FAO的代謝擾動實現ECM的沉積

為探究成纖維細胞活化與代謝轉變的關聯，通過轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導建立MRC-5成纖維細胞活化模型。結果顯示，隨TGF-β1濃度增加，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和I型膠原mRNA水平顯著升高（圖2A）。Western blot和免疫熒光分析表明，活化細胞中纖維連接蛋白、膠原蛋白I、彈性蛋白等ECM 蛋白表達顯著增加（圖2B-C）。線粒體熒光探針(Mito-Tracker)標記顯示，TGF-β1處理后線粒體信號強度顯著減弱，提示線粒體功能受損（圖2D）。同時，能量穩態核心調控因子AMP激活蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平(p-AMPK)顯著下降（圖2E），進一步表明代謝狀態異常。

qRT-PCR和Western blot顯示，活化成纖維細胞中糖酵解關鍵基因(HIF-1α、HK2、PFK2)及蛋白表達上調，而FAO相關基因(CPT1a、PPAR-γ)及蛋白水平下調，與硅肺小鼠肺組織中的代謝表型一致。細胞代謝功能檢測（ECAR和OCR）證實，活化細胞糖酵解能力增強，FAO水平降低（圖2H-I）。綜上，肺纖維化發展與成纖維細胞中FAO下調、糖酵解上調的代謝擾動密切相關。

3、抑制糖酵解或增強FAO會影響活化成纖維細胞中的ECM沉積

為探究代謝干預對ECM沉積的影響，使用糖酵解抑制劑3PO或FAO激活劑吡格列酮處理TGF-β1活化的成纖維細胞。結果顯示，兩種干預均能顯著減少ECM蛋白（纖維連接蛋白、膠原I、彈性蛋白）的表達（圖3A）。免疫熒光染色表明，3PO處理導致細胞外膠原I熒光信號減弱，而吡格列酮處理則使細胞內膠原I信號降低（圖3B），提示兩者通過不同機制影響膠原分布。進一步分析顯示，抑制糖酵解可減少不溶性ECM，同時增加培養基中可溶性膠原含量（圖3C-D），伴隨賴氨酸氧化酶(LOX)活性降低和甘氨酸合成減少（圖3E-F）；而增強FAO對ECM溶解度無顯著影響，但可促進溶酶體與膠原的共定位（圖3G），并增強外源性DQ-膠原的內吞降解（圖3H）。綜上，抑制糖酵解通過削弱ECM合成與修飾發揮作用，增強FAO則通過促進細胞內降解途徑抑制ECM沉積，兩者均能有效抑制纖維化相關ECM積累。

4、抑制糖酵解和增強脂肪酸氧化在體內的干預和治療效果

為驗證代謝干預的體內療效，構建二氧化硅誘導的肺纖維化小鼠模型，分別在暴露后立即（干預組）或纖維化形成后（治療組）給予糖酵解抑制劑3PO或FAO激活劑吡格列酮。干預結果（圖4A-B）顯示，暴露后立即給藥可顯著減輕肺泡結構破壞和肺纖維化程度，Masson染色和天狼星紅染色顯示Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白等ECM沉積顯著減少。然而，3PO干預組肺組織仍存在羥脯氨酸陽性染色（圖4B），提示殘留膠原降解不完全；吡格列酮干預組則通過CHP染色顯示細胞內膠原降解信號增強（圖4D），表明其促進ECM內吞降解的作用。

治療效果（圖5A-B）顯示，對已形成的纖維化（造模28天后給藥），吡格列酮僅部分緩解膠原沉積，而3PO可減輕肺損傷但仍有膠原碎片殘留。Western blot證實，兩種干預均能下調纖維連接蛋白、膠原I、彈性蛋白的表達（圖5C）。CHP染色（圖5D）進一步顯示，3PO治療組肺組織中CHP熒光強度較低，提示變性膠原減少；而吡格列酮組CHP信號較強且集中于細胞核周圍，表明其促進膠原內吞降解的作用。然而，羥脯氨酸染色與CHP結果不完全一致，可能因前者檢測完整膠原，后者特異性結合變性膠原，提示兩種藥物對ECM的作用路徑不同：3PO主要抑制膠原合成，吡格列酮則通過增強FAO促進膠原的細胞內降解。

5、HIF-1α調節成纖維細胞中脂肪酸氧化-糖酵解的轉化

為解析單一代謝干預的復雜效應，研究發現：3PO抑制糖酵解可顯著增加耗氧率(Oxygen Consumption Rates, OCR)，提示FAO代償性激活；而吡格列酮增強FAO僅輕度減少細胞外酸化率(Extracellular Acidification Rates, ECAR)，糖酵解未顯著受抑。這表明，單獨干預糖酵解或FAO會引發難以預測的代謝補償，因此篩選調控雙代謝途徑的核心因子尤為重要。

轉錄組分析顯示，HIF-1α在纖維化肺組織中顯著上調。進一步實驗（圖6B-C）顯示，在TGF-β1誘導的成纖維細胞活化模型中，HIF-1α mRNA和蛋白水平均呈時間依賴性升高：刺激24小時后，HIF-1α mRNA表達增加2.3倍（圖6B），蛋白水平在48小時達到峰值（圖6C），且其降解被環己酰亞胺(CHX)抑制，提示TGF-β1通過延長蛋白半衰期增強HIF-1α穩定性。免疫組化證實，特發性肺纖維化(IPF)和硅肺患者的纖維化區域中，HIF-1α表達上調，而FAO關鍵轉錄因子PPAR-γ表達下調，且兩者在小鼠硅肺模型中呈現一致趨勢（圖6A）。

機制研究表明，TGF-β1通過抑制HIF-1α泛素化，在常氧條件下穩定其蛋白水平。進一步功能實驗顯示，敲低HIF-1α可逆轉TGF-β1誘導的糖酵解增強（ECAR降低）和FAO減弱（OCR恢復），并恢復線粒體數量及AMPK活性（圖6D-H），證實HIF-1α是調控FAO-糖酵解代謝切換的核心分子。

6、HIF-1α抑制通過調節糖酵解-FAO代謝紊亂減少ECM沉積

為探究抑制HIF-1α能否通過調控糖酵解-FAO代謝失衡增強ECM清除，在MRC-5細胞中敲低HIF-1α，結果顯示ECM相關蛋白（如纖維連接蛋白、膠原I）表達顯著降低（圖7A）。免疫熒光證實，胞內及胞外膠原I熒光強度均顯著減弱（圖7C），表明HIF-1α抑制可有效減少體外TGF-β1誘導的ECM沉積。

機制研究發現，敲低HIF-1α后，膠原編碼基因（如 COL1A1）轉錄水平未顯著改變（圖7B），但ECM修飾酶(LOX、LOXL2、P4AH1、PLOD1、PLOD2)的mRNA 水平顯著下調（圖7D），伴隨LOX酶活性降低和可溶性膠原增加（圖7F）。此外，成纖維細胞對DQ-膠原的內吞效率及溶酶體共定位顯著增強（圖7G-I），提示ECM交聯減少且降解途徑激活。

7、抑制HIF-1α調節的脂肪酸氧化-糖酵解代謝擾動在體內減輕肺纖維化

為驗證HIF-1α抑制的體內治療效果，在二氧化硅粉塵滴注后的第二天或已形成纖維化的小鼠（造模28天后），分別用兩種代謝調節劑（3PO聯合吡格列酮）或一種HIF-1α抑制劑(LW6)處理小鼠，以評估干預或治療效果（圖8A和圖9A）。

對小鼠肺組織進行的H&E染色顯示，LW6組和3PO聯合吡格列酮組小鼠的肺部纖維化程度有所減輕。此外，Masson染色和羥脯氨酸免疫組化結果表明，小鼠肺組織中的膠原沉積相對減少。同時，天狼星紅染色顯示膠原沉積減少，偏振光顯微鏡觀察發現，LW6組和3PO聯合吡格列酮組中復雜且緊密堆積的膠原減少（圖8B和圖9B）。Western blot結果顯示，LW6組和3PO聯合吡格列酮組中纖連蛋白、I型膠原和彈性蛋白的表達下調（圖8C和圖9C）。與此一致的是，研究者發現纖維化病變的嚴重程度和位置有了明顯改善（圖8D和圖9D）。這些結果表明，在體內抑制HIF-1α調控的代謝轉變能夠有效減少暴露于二氧化硅粉塵的小鼠肺部ECM的過度沉積。

本研究發現，在二氧化硅誘導的肺纖維化中，糖酵解增強和FAO減少，促使細胞外基質合成與降解失衡，推動疾病發展。HIF-1α在調節FAO-糖酵解代謝轉換、影響ECM重塑方面至關重要。因此，代謝療法或靶向HIF-1α有望成為清除纖維化ECM、改善肺功能的有效策略。