基本信息
題目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
合作技術(shù)：EMSA
研究背景
抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化劑，可以清除植物在脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧。本文通過酵母單雜交技術(shù)、瞬時(shí)表達(dá)和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子結(jié)合，且SlHZ24表達(dá)水平與AsA積累呈正相關(guān)特性。相反，通過RNAi技術(shù)導(dǎo)致AsA表達(dá)量降低。SlHZ24同時(shí)也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達(dá)，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說明抗壞血酸合成為多靶點(diǎn)調(diào)控。SlHZ24過表達(dá)植株對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進(jìn)抗壞血酸的合成，提高了植株對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族
本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galactose途徑中關(guān)鍵GMP基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據(jù)報(bào)道GMP家族中只有過表達(dá)SIGMP3提高了抗壞血酸的表達(dá)且改善了氧化應(yīng)激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動(dòng)子作用調(diào)節(jié)抗壞血酸的轉(zhuǎn)錄因子，共找到25個(gè)潛在蛋白，確認(rèn)SlHZ24 為研究對(duì)象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結(jié)構(gòu)域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進(jìn)化分析的結(jié)果也說明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。
題目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
合作技術(shù)：EMSA
研究背景
抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化劑，可以清除植物在脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧。本文通過酵母單雜交技術(shù)、瞬時(shí)表達(dá)和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子結(jié)合，且SlHZ24表達(dá)水平與AsA積累呈正相關(guān)特性。相反，通過RNAi技術(shù)導(dǎo)致AsA表達(dá)量降低。SlHZ24同時(shí)也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達(dá)，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說明抗壞血酸合成為多靶點(diǎn)調(diào)控。SlHZ24過表達(dá)植株對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進(jìn)抗壞血酸的合成，提高了植株對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族
本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galactose途徑中關(guān)鍵GMP基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據(jù)報(bào)道GMP家族中只有過表達(dá)SIGMP3提高了抗壞血酸的表達(dá)且改善了氧化應(yīng)激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動(dòng)子作用調(diào)節(jié)抗壞血酸的轉(zhuǎn)錄因子，共找到25個(gè)潛在蛋白，確認(rèn)SlHZ24 為研究對(duì)象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結(jié)構(gòu)域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進(jìn)化分析的結(jié)果也說明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。
2. 酵母雙/單雜交驗(yàn)證SlHZ24反式激活作用
使用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實(shí)驗(yàn)組可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生長，而對(duì)照組不能生長（圖2a）。使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同長度SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子的作用，其中SlHZ24全長、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為正常生長，N1不包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為細(xì)胞不生長，N2包含不完整的HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為生長緩慢，說明HD結(jié)構(gòu)域?yàn)榛プ鼋Y(jié)構(gòu)域（圖2a）。
使用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實(shí)驗(yàn)組可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生長，而對(duì)照組不能生長（圖2a）。使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同長度SlHZ24和SIGMP3啟動(dòng)子的作用，其中SlHZ24全長、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為正常生長，N1不包含HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為細(xì)胞不生長，N2包含不完整的HD結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為生長緩慢，說明HD結(jié)構(gòu)域?yàn)榛プ鼋Y(jié)構(gòu)域（圖2a）。
3. 瞬轉(zhuǎn)及雙螢光素酶檢測驗(yàn)證SlHZ24與SlGMP3啟動(dòng)子結(jié)合
將SlGMP3啟動(dòng)子分成4段進(jìn)行雙螢光素酶檢測實(shí)驗(yàn)（圖3a、3b），P1和P2啟動(dòng)子區(qū)域檢測到熒光增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SlHZ24結(jié)合SlGMP3啟動(dòng)子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結(jié)合區(qū)段。
將SlGMP3啟動(dòng)子分成4段進(jìn)行雙螢光素酶檢測實(shí)驗(yàn)（圖3a、3b），P1和P2啟動(dòng)子區(qū)域檢測到熒光增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SlHZ24結(jié)合SlGMP3啟動(dòng)子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結(jié)合區(qū)段。
4．進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SlHZ24和SlGMP3結(jié)合
使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的結(jié)合情況（圖4a），結(jié)果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)為-2411到-2313bp，突變實(shí)驗(yàn)也證明了這個(gè)結(jié)果（圖4b）。EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了該結(jié)論（圖4c）。這些結(jié)果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結(jié)合來啟動(dòng)下游表達(dá)。
使用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的結(jié)合情況（圖4a），結(jié)果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)為-2411到-2313bp，突變實(shí)驗(yàn)也證明了這個(gè)結(jié)果（圖4b）。EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了該結(jié)論（圖4c）。這些結(jié)果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結(jié)合來啟動(dòng)下游表達(dá)。
5. 不同番茄組織及轉(zhuǎn)基因番茄中SlGMP3和SlHZ24檢測
使用qPCR對(duì)番茄不同組織中的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)兩者都在莖和葉總的表達(dá)量較高（圖5a），說明SIHZ24正向調(diào)節(jié)SlGMP3表達(dá)。為了驗(yàn)證SlHZ24對(duì)SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖5b）。
使用qPCR對(duì)番茄不同組織中的SlGMP3啟動(dòng)子和SlHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)兩者都在莖和葉總的表達(dá)量較高（圖5a），說明SIHZ24正向調(diào)節(jié)SlGMP3表達(dá)。為了驗(yàn)證SlHZ24對(duì)SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖5b）。
6. SIHZ24通過調(diào)節(jié)SlGMP3表達(dá)來改變AsA的合成
對(duì)過表達(dá)、干擾番茄葉及果實(shí)中AsA的檢測（圖6a 、6b）實(shí)驗(yàn)，說明SlHZ24在番茄葉和果實(shí)中同時(shí)調(diào)節(jié)抗壞血酸的合成。過表達(dá)SlHZ24的OX-13植株果實(shí)中SlGMP3基因的表達(dá)量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實(shí)中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量顯著減少，而過表達(dá)SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6c）。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄中其他GMP家族基因的檢測結(jié)果說明SlHZ24可能調(diào)節(jié)多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。
對(duì)過表達(dá)、干擾番茄葉及果實(shí)中AsA的檢測（圖6a 、6b）實(shí)驗(yàn)，說明SlHZ24在番茄葉和果實(shí)中同時(shí)調(diào)節(jié)抗壞血酸的合成。過表達(dá)SlHZ24的OX-13植株果實(shí)中SlGMP3基因的表達(dá)量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實(shí)中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量顯著減少，而過表達(dá)SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達(dá)量變化不大（圖6c）。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄中其他GMP家族基因的檢測結(jié)果說明SlHZ24可能調(diào)節(jié)多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。
7. 番茄中AsA和SlGMP3檢測
為了檢測番茄果實(shí)成熟過程中SIHZ24如何影響SIGMP3對(duì)不同時(shí)期果實(shí)的AsA和SlGMP3表達(dá)量進(jìn)行了檢測（圖7a、7b），結(jié)果表明SlHZ24在番茄成熟的過程中可以調(diào)節(jié)SlGMP3的表達(dá)，其中以破色期果實(shí)調(diào)控效應(yīng)最為顯著，除了紅果實(shí)成熟期。
為了檢測番茄果實(shí)成熟過程中SIHZ24如何影響SIGMP3對(duì)不同時(shí)期果實(shí)的AsA和SlGMP3表達(dá)量進(jìn)行了檢測（圖7a、7b），結(jié)果表明SlHZ24在番茄成熟的過程中可以調(diào)節(jié)SlGMP3的表達(dá)，其中以破色期果實(shí)調(diào)控效應(yīng)最為顯著，除了紅果實(shí)成熟期。
8. SlHZ24轉(zhuǎn)基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達(dá)檢測
使用qPCR對(duì)番茄的葉和果實(shí)進(jìn)行了檢測（圖8a、8b），結(jié)果表明在野生型和轉(zhuǎn)基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達(dá)量發(fā)生了改變，顯示SlHZ24的多點(diǎn)協(xié)同調(diào)控作用。
使用qPCR對(duì)番茄的葉和果實(shí)進(jìn)行了檢測（圖8a、8b），結(jié)果表明在野生型和轉(zhuǎn)基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達(dá)量發(fā)生了改變，顯示SlHZ24的多點(diǎn)協(xié)同調(diào)控作用。
9. SIGME2、SIGGP啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)
使用EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24和啟動(dòng)子SIGME2、SIGGP有互做關(guān)系。
使用EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24和啟動(dòng)子SIGME2、SIGGP有互做關(guān)系。
10. SlHZ24光響應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用
為了研究光對(duì)AsA的作用，作者對(duì)不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測（圖10a、10b），結(jié)果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達(dá)也隨之提高。使用MV對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行處理，同時(shí)對(duì)葉綠素和MDA濃度進(jìn)行檢測，說明SIHZ24過表達(dá)可以提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。
為了研究光對(duì)AsA的作用，作者對(duì)不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達(dá)量進(jìn)行了檢測（圖10a、10b），結(jié)果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達(dá)也隨之提高。使用MV對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行處理，同時(shí)對(duì)葉綠素和MDA濃度進(jìn)行檢測，說明SIHZ24過表達(dá)可以提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。
文章小結(jié)
目前植物合成AsA基礎(chǔ)途徑已經(jīng)明確，但對(duì)AsA合成代謝的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本文研究了番茄轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24結(jié)合SIGMP3啟動(dòng)子從而增加AsA表達(dá)水平的機(jī)制，進(jìn)而提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類小分子抗氧化劑物質(zhì)，能清除體內(nèi)活性氧，增強(qiáng)有機(jī)體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進(jìn)行。不過人類自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控果實(shí)AsA積累的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)揭示AsA調(diào)控機(jī)制和未來品質(zhì)改良具有重要意義。
解析文獻(xiàn)
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
參考文獻(xiàn)
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.
目前植物合成AsA基礎(chǔ)途徑已經(jīng)明確，但對(duì)AsA合成代謝的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本文研究了番茄轉(zhuǎn)錄因子SlHZ24結(jié)合SIGMP3啟動(dòng)子從而增加AsA表達(dá)水平的機(jī)制，進(jìn)而提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類小分子抗氧化劑物質(zhì)，能清除體內(nèi)活性氧，增強(qiáng)有機(jī)體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進(jìn)行。不過人類自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控果實(shí)AsA積累的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)揭示AsA調(diào)控機(jī)制和未來品質(zhì)改良具有重要意義。
解析文獻(xiàn)
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
參考文獻(xiàn)
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.