1、人腺樣體的細(xì)胞組成與譜系界定

為解析上呼吸道黏膜相關(guān)淋巴組織的細(xì)胞組成，研究人員收集6名接受選擇性腺樣體切除術(shù)捐贈(zèng)者的臨床腺樣體組織，通過單細(xì)胞核RNA測(cè)序(snRNA-seq)分析16,779個(gè)細(xì)胞核（圖1A）。經(jīng)UMAP降維后，通過手動(dòng)核對(duì)各細(xì)胞核群體的細(xì)胞類型基因表達(dá)標(biāo)志物，鑒定出3種細(xì)胞核譜系（圖1B）：

• 造血細(xì)胞譜系：因高表達(dá)蛋白酪氨酸磷酸酶受體C（PTPRC，即CD45）、分化簇38(CD38)和信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員1(SLAMF1)被明確界定，該譜系共包含11,514個(gè)細(xì)胞核；

• 基底/丘狀譜系：該譜系表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)、角蛋白8(KRT8)、蛋白酶體26S亞基非ATP酶5(PSMD5)等基底祖細(xì)胞、丘狀細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記，共包含2,796個(gè)細(xì)胞核；

• 杯狀細(xì)胞譜系：表達(dá)鈣黏蛋白相關(guān)家族成員3(CDHR3)、叉頭框J1(FOXJ1)、黏蛋白5B(MUC5B)等纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及微皺褶細(xì)胞（M細(xì)胞）標(biāo)記（如腫瘤壞死因子受體超家族成員 11a，TNFRSF11A），共包含2,469個(gè)細(xì)胞核；

且基底/丘狀譜系與杯狀細(xì)胞譜系均不表達(dá)免疫細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記及差異表達(dá)基因(DEGs)（圖1C）。

與此同時(shí)，模塊分?jǐn)?shù)分析表明：造血譜系細(xì)胞核表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)記CD19、T細(xì)胞受體ζ鏈CD247、樹突狀細(xì)胞標(biāo)記ITGAX(CD11c)等免疫細(xì)胞標(biāo)記；基底/丘狀譜系表達(dá)IGFBP3、XVII型膠原α1鏈(COL17A1)、KRT8等相關(guān)基因；杯狀細(xì)胞譜系表達(dá)分泌珠蛋白 1A1(SCGB1A1)、CDHR3、MUC5AC/5B及 TNFRSF11A（圖1D-F）。

2、造血譜系細(xì)胞的表征

在確定造血譜系簇后，研究人員利用UMAP降維進(jìn)行細(xì)胞亞群分析，共鑒定出15種免疫相關(guān)細(xì)胞類型（圖2A）。與此同時(shí)，比例分析顯示，造血譜系中B細(xì)胞、T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例與先前研究一致，NK細(xì)胞略高，濾泡樹突狀細(xì)胞等因稀缺性與其他次級(jí)淋巴組織相符。值得注意的是，濾泡樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征含造血譜系標(biāo)記（圖2B）。

3、基底/丘狀譜系細(xì)胞群體的表征

研究人員對(duì)基底/丘狀譜系進(jìn)行亞群分析，分別鑒定出基底細(xì)胞祖細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、簇細(xì)胞、丘狀細(xì)胞及未知細(xì)胞類型(UCT)（圖3A）。5個(gè)細(xì)胞亞群差異表達(dá)基因(DEGs)顯示，UCT除基底細(xì)胞DEGs外，還高表達(dá)干擾素刺激基因(ISGs)，具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征（圖3B）。

擬時(shí)序分析顯示：基底來源細(xì)胞聚集，丘狀細(xì)胞獨(dú)立成簇，是兩條不同分化路徑（圖3C），且丘狀細(xì)胞起源顯著早于其他細(xì)胞簇，而基底相關(guān)簇呈現(xiàn)的中位擬時(shí)序值相近，反映其共同源自基底細(xì)胞（圖3D）。不同細(xì)胞亞群的代表性DEGs擬時(shí)序分析，再次印證了基底來源細(xì)胞與丘狀細(xì)胞不同起源；以及基底相關(guān)簇細(xì)胞的DEGs表達(dá)模式可能與丘狀細(xì)胞不同（圖3E）。這些結(jié)果闡述了人腺樣體中基底細(xì)胞、其后代及丘狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征，并首次發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征的UCT。

4、“未知細(xì)胞類型”(UCT)是具有獨(dú)特干擾素相關(guān)基因特征的基底細(xì)胞后代

研究人員對(duì)UCT進(jìn)行探究，結(jié)果顯示，UCT的顯著DEGs的表達(dá)水平與其他基底/丘狀譜系細(xì)胞差異顯著，且在人腺樣體所有細(xì)胞核群體中獨(dú)特表達(dá)（圖 4A）；而新鑒定的UCT特異性DEGs與僅基于基底/丘狀譜系分析的結(jié)果高度重疊，顯著DEGs幾乎一致（圖4B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)UCT的DEGs富集于三類生物學(xué)過程：細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、感染反應(yīng)、遷移與分化。細(xì)胞間通訊進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，UCT與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、γ-δ T細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞等存在強(qiáng)相互作用，其中與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的相互作用最強(qiáng)（圖4C），主要通過PTPRM通路和THBS1-SDC4通路實(shí)現(xiàn)（圖4D）。

此外人腭扁桃體單細(xì)胞圖譜中標(biāo)記為“VEGFA+細(xì)胞”的群體也表達(dá)UCT的DEGs（圖4E）。免疫熒光驗(yàn)證顯示，IFIT3、IFIH1、DDX58在人腺樣體上皮細(xì)胞中共定位，且在4名獨(dú)立捐贈(zèng)者中均存在（圖5A）。驗(yàn)證細(xì)胞間互作發(fā)現(xiàn)，UCT與FYN陽(yáng)性細(xì)胞接近，且與僅表達(dá)CFTR的基底衍生細(xì)胞相鄰（圖5B-D）。

綜上表明，UCT是基底細(xì)胞譜系中具有獨(dú)特干擾素相關(guān)基因特征的細(xì)胞類型，參與感染反應(yīng)相關(guān)過程，并與其他細(xì)胞存在特異性相互作用。

5、杯狀細(xì)胞譜系細(xì)胞群體的表征

研究人員對(duì)杯狀相關(guān)細(xì)胞譜系進(jìn)行亞群再分析，并標(biāo)記出獨(dú)特細(xì)胞核群體（圖6A）。與此同時(shí)，杯狀細(xì)胞譜系中的分泌型杯狀細(xì)胞分為兩型：杯狀細(xì)胞-1表達(dá)MUC5AC/5B，杯狀細(xì)胞-2表達(dá)MUC4、IL19等，兩者共享BPIFB1、PIGR等黏液相關(guān)DEGs但表達(dá)水平不同（圖6B）。而M細(xì)胞分為未成熟和成熟兩群，未成熟M細(xì)胞DEGs平均表達(dá)低于成熟型，與小鼠胃腸道M細(xì)胞分化中過渡群體的描述一致（圖6B）。

Monocle 3軌跡分析發(fā)現(xiàn)：杯狀細(xì)胞主要位于中心，纖毛細(xì)胞富集于左側(cè)，M細(xì)胞在右側(cè)，兩群杯狀細(xì)胞在中央重疊（圖6C）。擬時(shí)序分析顯示，杯狀細(xì)胞為最早出現(xiàn)的細(xì)胞，隨后是兩群杯狀細(xì)胞和未成熟M細(xì)胞，成熟M細(xì)胞和纖毛細(xì)胞中位偽時(shí)間值較大（圖6D）。 顯著DEGs表達(dá)模式顯示：杯狀細(xì)胞的SNX29在軌跡中央細(xì)胞中高表達(dá)；纖毛細(xì)胞的CDHR3在軌跡左側(cè)表達(dá)增加；杯狀細(xì)胞的MUC5B/MUC4在軌跡兩分支重疊表達(dá)；未成熟M細(xì)胞的SOX5在對(duì)應(yīng)軌跡區(qū)域表達(dá)；成熟M細(xì)胞的CEMIP在軌跡右側(cè)末端高表達(dá)（圖6E）。研究者進(jìn)一步提出了細(xì)胞分化模型：杯狀細(xì)胞祖細(xì)胞先分化為未成熟M細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，未成熟M細(xì)胞進(jìn)一步分化為成熟M細(xì)胞，纖毛細(xì)胞經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間直接源自杯狀細(xì)胞；杯狀細(xì)胞-1為向杯狀細(xì)胞-2過渡的中間群體（圖6F）。 這些結(jié)果闡述了杯狀相關(guān)譜系及其分化路徑。

6、人腺樣體M細(xì)胞的表征

研究人員進(jìn)一步參考人胃腸道、類器官及小鼠肺M細(xì)胞的潛在標(biāo)記物，對(duì)M細(xì)胞進(jìn)行分析（圖7A）。結(jié)果顯示，成熟M細(xì)胞高表達(dá)SPIB、TNFRSF11A及TNFAIP2，而GP2、CCL20及TNFRSF11B表達(dá)極低或未檢測(cè)到（圖7A）。

成熟M細(xì)胞的DEGs分析發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞譜系分析與全細(xì)胞分析的DEGs大部分重疊，僅少數(shù)基因特有。全細(xì)胞分析的顯著DEGs包括CEMIP、MYBPC1等與黏膜免疫相關(guān)的基因（圖7B）。通路分析顯示，成熟M細(xì)胞富集細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)及運(yùn)輸相關(guān)通路，與M細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞功能一致。細(xì)胞通訊分析表明，未成熟M細(xì)胞與暗區(qū)B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞等相互作用最強(qiáng)；成熟M細(xì)胞則與基底細(xì)胞、UCT等作用顯著（圖7C）。未成熟M細(xì)胞主要通過PTPRC-CD22通路與免疫細(xì)胞作用，成熟M細(xì)胞主要依賴PTPRM-PTPRM通路（圖7D）。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，CEMIP與M細(xì)胞標(biāo)記NKM 16-2-4、TNFAIP2共定位（圖8A）。成熟M細(xì)胞與UCT及基底衍生細(xì)胞在接觸點(diǎn)附近有PTPRM表達(dá)（圖8B）；未成熟M細(xì)胞（CDH18陽(yáng)性）與暗區(qū)增殖性B細(xì)胞（MAST2陽(yáng)性）、FYN陽(yáng)性細(xì)胞通過CD22在接觸部位相互作用（圖8C-E）。這些結(jié)果表征了人腺樣體中未成熟和成熟兩群M細(xì)胞的分子特征、功能通路及與其他細(xì)胞的相互作用。

7、人腺樣體M細(xì)胞差異表達(dá)基因的比較分析

研究人員將M細(xì)胞的DEGs與先前的氣道和胃腸道細(xì)胞圖譜研究進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未成熟M細(xì)胞的DEGs中，僅DOCK8、PLGC2、TNFAIP8在幾乎所有人扁桃體上皮細(xì)胞中顯著表達(dá)（圖9A）。與此同時(shí)，相比小鼠肺和氣管M細(xì)胞圖譜，人成熟M細(xì)胞的CEMIP、MYBPC1等DEGs幾乎低表達(dá)或不表達(dá)；而未成熟M細(xì)胞DEGs在小鼠圖譜中無一致模式（圖9B-C）。

進(jìn)一步與經(jīng)RANKL處理的小鼠腸道類器官M(fèi)細(xì)胞比較顯示，該體外誘導(dǎo)的M細(xì)胞群體顯著表達(dá)上述4個(gè)成熟M細(xì)胞DEGs，且表達(dá)人腺樣體未成熟M細(xì)胞標(biāo)記物DOCK8、PLGC2、TNFAIP8（圖9D）。這些結(jié)果表明，人腺樣體M細(xì)胞存在獨(dú)特表達(dá)的基因，凸顯空間定位對(duì)M細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響。

本研究通過單細(xì)胞核RNA測(cè)序(snRNA-seq)，對(duì)6名健康供體的人腺樣體組織進(jìn)行分析，構(gòu)建出含26種獨(dú)特細(xì)胞類型的圖譜，涵蓋造血、基底/丘狀、杯狀細(xì)胞三大譜系。研究明確人氣道M細(xì)胞源于杯狀細(xì)胞祖細(xì)胞，分未成熟與成熟兩群，成熟M細(xì)胞高表達(dá)SPIB等基因且富集與轉(zhuǎn)胞吞功能相關(guān)的通路；還在基底/丘狀譜系發(fā)現(xiàn)高表達(dá)干擾素刺激基因的未知細(xì)胞類型UCT，并厘清杯狀細(xì)胞譜系分化路徑。結(jié)合軌跡分析、細(xì)胞通訊預(yù)測(cè)及免疫熒光驗(yàn)證，研究為理解氣道黏膜免疫、病原體早期相互作用及黏膜疫苗研發(fā)提供重要依據(jù)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：是在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行高通量測(cè)序的技術(shù)，能夠有效解決細(xì)胞異質(zhì)性，有助于發(fā)現(xiàn)新的稀有細(xì)胞類型，深入了解細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。利用微流控系統(tǒng)通過序列標(biāo)簽（barcode和UMI）區(qū)別群體中的不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄本，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜。

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：通過對(duì)樣本包埋切片并與檢測(cè)芯片結(jié)合，利用序列標(biāo)簽（spatial barcode和UMI）區(qū)別不同細(xì)胞的空間位置，可高效檢測(cè)組織中空間原始位置上的基因表達(dá)模式，兩者聯(lián)合可同時(shí)獲取細(xì)胞類型、功能及空間定位信息。

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