題目：NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma
stem-like cells
期刊：Cancer Research（IF=9.13）
合作技術(shù)：細(xì)胞系培養(yǎng)和鑒定
研究背景
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人最常見、最難治療的原發(fā)性腦腫瘤，其腫瘤的發(fā)生發(fā)展與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）相關(guān)，因此針對這種細(xì)胞亞群的研究有利于膠質(zhì)瘤的臨床治療。鑒于GSCs位于特殊的微環(huán)境中，且其誘導(dǎo)和維持機(jī)制在很大程度上仍然是未知的，所以揭示促使GSCs遷移侵襲和自我更新的分子機(jī)制對于GSCs定向治療的發(fā)展具有重要意義。在本篇文獻(xiàn)中，作者深入研究活化T細(xì)胞-1的鈣反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（NFAT1）在GSCs中的作用，并報(bào)告了一種新的GSCs維持途徑，即NFAT1- NDEL1軸（NDEL1是NFAT1下游靶點(diǎn)，神經(jīng)發(fā)育蛋白1）將成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療策略的重要目標(biāo)。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征與NFAT1表達(dá)量有關(guān)
在前期膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NFAT1系列研究基礎(chǔ)上，作者根據(jù)TCGA（癌癥和腫瘤基因圖譜）和Gravendeel（公開的臨床數(shù)據(jù)集）統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的間充質(zhì)亞型中NFAT1表達(dá)水平高于其他幾種亞型（圖1A），且NFAT1表達(dá)不僅與干細(xì)胞基因（CD44/Vimentin）和間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因（REL/LYN/TGFBR2）表達(dá)顯著相關(guān)，也與膠質(zhì)瘤的預(yù)后較緩相關(guān)（圖1B-1C）。接下來，從新鮮的臨床多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）等樣本中分離出GSCs，進(jìn)行細(xì)胞系鑒定和富集培養(yǎng)，通過RT-qRCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NFAT1高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性亞型和GSCs的生長侵襲有關(guān)（圖1D-1E）。
圖1 NFAT1表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征的關(guān)系
2. NFAT1影響GSCs的生長和侵襲
為確定NFAT1對GSCs的生理影響，一方面，采用兩個(gè)獨(dú)立的shRNAs分別去轉(zhuǎn)導(dǎo)高表達(dá)NFAT1的LN229和G10 GSCs細(xì)胞。WB結(jié)果證實(shí)，其中一個(gè)NFAT1 shRNAs (shNFAT1-2) 轉(zhuǎn)導(dǎo)LN229和G10 GSCs后NFAT1減少了80%以上（圖2A）；體外細(xì)胞活性測定和流式分析顯示，NFAT1沉默顯著地降低GSCs的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖2B-2C）；此外，通過傷口愈合分析、Transwell分析和三維球體侵入分析得到，shNFAT1-2感染GSCs后細(xì)胞遷移和侵入行為顯著減少，且GSCs球體形成能力下降（圖2D-2G）。
另一方面，在基礎(chǔ)水平較低的T98G和G03 GSCs中實(shí)現(xiàn)NFAT1過表達(dá)（圖3A）。通過一系列細(xì)胞生物學(xué)檢測得到，NFAT1過表達(dá)顯著地增強(qiáng)細(xì)胞活性并抑制凋亡（圖3B-3C）、增加了GSCs的遷移和入侵（圖3D-3F）；同時(shí)電鏡圖顯示NFAT1刺激GSCs的神經(jīng)球的形成過程（圖4G）。
圖2 NFAT1的沉默抑制GSCs的生長和侵襲
圖3 NFAT1的過表達(dá)促進(jìn)GSCs的生長和侵襲
3. NFAT1對體內(nèi)GSCs腫瘤生長具有重要意義
采用顱內(nèi)小鼠模型，探究NFAT1沉默和過表達(dá)對體內(nèi)GSCs腫瘤生長的影響。大腦切片染色結(jié)果顯示，與對照shRNA相比，NFAT1的敲除組顯著地抑制顱內(nèi)腫瘤生長（圖4A-4B）；Kaplan–Meier生存曲線顯示T98G和G03 GSCs的細(xì)胞生存率增加，進(jìn)而可推測出NFAT1 shRNAs（shNFAT1-1和shNFAT1-2）將更有效地延長小鼠生存期（圖4C-4F）。綜上所述，NFAT1在體外和體內(nèi)都促進(jìn)GSCs的腫瘤發(fā)生。
圖4 NFAT1表達(dá)影響體內(nèi)GSCs的生長
4. NDEL1鑒定為NFAT1下游靶基因
通過開展轉(zhuǎn)錄組測序來確定NFAT1的潛在下游靶點(diǎn)，從熱圖數(shù)據(jù)中分別初篩出50個(gè)NFAT1沉默后下調(diào)基因和NFAT1過表達(dá)后上調(diào)的基因，上述均有可能是NFAT1介導(dǎo)的腫瘤促進(jìn)基因（圖5A-5B）；結(jié)合TCGA和Gravendel數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NDEL1表達(dá)量在復(fù)發(fā)性GBMs中顯著地上調(diào)且涉及到間質(zhì)過渡和干度增加的生理過程（圖5C-5D），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)GSCs細(xì)胞的NDEL1表達(dá)水平明顯高于原神經(jīng)性GSCs細(xì)胞（圖5E-5F）。與此同時(shí)，在挖掘REMBRANDT補(bǔ)充數(shù)據(jù)集后發(fā)現(xiàn)，NDEL1表達(dá)不僅與GBMs低存活率相關(guān)，還參與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。
圖5 神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)
5. NDEL1由NFAT1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并參與GSCs的發(fā)生發(fā)展
通過蛋白質(zhì)印跡分析初步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，NFAT1的沉默顯著地降低了NDEL1的表達(dá)，且NFAT1的過表達(dá)顯著地增加了NDEL1的表達(dá)（圖6A-6B）；雙標(biāo)記免疫熒光染色測定出在G10 GSC中NFAT1對NDEL1具有調(diào)節(jié)作用（圖6C-6D）；采用熒光素酶分析法檢測NAFT1對NDEL1啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)合ChIP-qPCR芯片分析得出NFAT與NDEL1啟動(dòng)子結(jié)合（圖6E-6G）。鑒于NDEL1在GSCs生長和入侵中的作用機(jī)制尚未確定，由此使用兩個(gè)獨(dú)立的shRNAs來穩(wěn)定地沉默G10 GSCs的NDEL1（圖6H）；陸續(xù)通過WB檢測、流式分析、基質(zhì)凝膠分析、三維球體侵入分析得到，NDEL1的沉默顯著降低了G10 GSCs的侵入能力，且在很大程度上抑制了G10 GSCs的自我更新能力（圖6I-6M）。
圖6 NDEL1由NFAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)
6. 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表達(dá)可部分恢復(fù)腫瘤生長和侵襲
為了進(jìn)一步研究NFAT1是否通過調(diào)節(jié)NDEL1表達(dá)來部分支持GSCs的攻擊行為，作者在FAT1沉默的G10 GSCs中建立NDEL1重新表達(dá)的體系（圖7A），發(fā)現(xiàn)NDEL1重新表達(dá)可部分恢復(fù)GSCs的生理活性，并減少了NFAT1沉默誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖7B-7C）。根據(jù)基質(zhì)凝膠分析、三維球體侵入分析和神經(jīng)球形成檢測，得到NFAT1敲除后抑制的GSCs侵襲作用被NDEL1重新表達(dá)所挽救（圖7D-7E）并恢復(fù)了自我更新能力（圖7F-7G）；此外，大腦切片染色等體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，通過NDEL1重新表達(dá)僅部分非完全地緩解NFAT1基因敲除后體內(nèi)腫瘤生長的抑制效應(yīng)，也很可能涉及更多的未知途徑。
圖7 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表達(dá)可恢復(fù)體外和體內(nèi)的腫瘤生長
文章小結(jié)
本文旨在探討NFAT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過基因敲除和過表達(dá)進(jìn)行初步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)NFAT1表達(dá)與膠質(zhì)瘤的侵襲性表型和生存率相關(guān)；RNA測序顯示NFAT1的缺失與NDEL1表達(dá)關(guān)聯(lián)；結(jié)合挽救實(shí)驗(yàn)說明NFAT1調(diào)控了NDEL1的啟動(dòng)子活性，NFAT1-NDEL1信號(hào)上調(diào)后激活ERK去提高GSCs干細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白水平和細(xì)胞分化水平。綜上所述，NFAT1通過調(diào)節(jié)NDEL1去部分控制GSCs的生長和侵襲，以NFAT1-NDEL1軸為靶點(diǎn)可為膠質(zhì)瘤患者提供較大可能的治療機(jī)會(huì)。
解析文獻(xiàn)
Jiang Y, Song YF, Wang R, et al. NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma stem-like cells. Cancer Res. 2019 Apr 2，DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3297.