對于做分子實驗的人來說，探針引物，一個很熟悉的詞語，科研人員也會經(jīng)常用到，但是對于探針引物的設(shè)計，您知道多少？今天，我們就簡單的談下這種引物的設(shè)計。
通用原則
1. 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近于探針；
2. 擴(kuò)增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在100－150bp內(nèi)，擴(kuò)增片斷越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得，較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性；
3. 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，及在SG分析中非特異信號；
4. 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）；
5. 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
探針設(shè)計指導(dǎo)
1. 在設(shè)計引物之前設(shè)計探針；
2. 探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)；
3. 探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在；
4. 選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。
5. 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個bp。
6. 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。
引物設(shè)計指導(dǎo)
1. 引物的Tm值應(yīng)在58－60℃之間，這非常重要，因為我們的試驗一般都使用退火溫度為60℃，在這個溫度下，5’核酸外切酶的活性最高。
2. 引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。
3. 將引物盡量接近于探針
循環(huán)參數(shù)
當(dāng)引物和探針按照上述原則設(shè)計好后，循環(huán)的參數(shù)也就確定了，當(dāng)經(jīng)過起始的變性溫度后(根據(jù)Tag酶要求設(shè)定)，反應(yīng)要經(jīng)過95℃，15－20秒，60℃，60秒，對于一些模板，45秒也足夠了，數(shù)據(jù)在退火時檢測。
優(yōu)化探針和引物的濃度
對于雙探針反應(yīng)，通過選擇探針和引物的濃度來優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果，能獲得最低的CT值，以及相對于背景來說熒光值有最高的增長。引物濃度應(yīng)該在50nM-900nM 范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，探針濃度應(yīng)該在50－250nM范圍內(nèi)優(yōu)。探針的濃度應(yīng)該從（50，100，250nM）與引物濃度相組合，在Rotor-Gene上進(jìn)行試驗，選擇最小CT值和最高反應(yīng)擴(kuò)增的曲線做后續(xù)試驗。
通常所用的探針和引物濃度分別為250nM 和900nM，絕大多數(shù)反應(yīng)都可以在這個濃度下進(jìn)行，但為了尋找最佳的濃度，還是應(yīng)該依照上述的步驟。由于引物溶解溫度預(yù)測的差異和多種探針設(shè)計程序，因此使用三種退火溫度（58℃，60℃，62℃）對優(yōu)化是很有用的。引物的濃度也會影響溶解溫度，高的引物濃度會讓溶解溫度提高2度左右。Primer3是個非常有用的軟件，但它不能避免3‘端的G，所以應(yīng)將3’端的G去除，并觀察探針的退火溫度是否比引物高8－10度。
定量數(shù)據(jù)的分析
分析定量數(shù)據(jù)主要有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量。研究人員應(yīng)該根據(jù)擴(kuò)增子和試驗?zāi)康膩頉Q定如何分析定量數(shù)據(jù)。
（1）絕對定量
絕對定量是將未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較進(jìn)行分析，一般標(biāo)準(zhǔn)品就是一個已知絕對濃度的DNA樣品，關(guān)于何種標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線一直有很多討論，理想的標(biāo)準(zhǔn)品其擴(kuò)增方式應(yīng)該是與待測樣品一致得，然而這往往是不可能的。一些人會克隆他們得目的基因，并與未知樣品比較。要注意得是，絕對定量分析的準(zhǔn)確性是依靠標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性得。
在Rotro-Gene 上可以用幾種方法來分析絕對定量數(shù)據(jù)。包括標(biāo)準(zhǔn)曲線在內(nèi)的R值，反應(yīng)效率都會被呈現(xiàn)出來。也可以從以外的分析中調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線并讓它與一個標(biāo)準(zhǔn)品相調(diào)整，（或重復(fù)相同的標(biāo)準(zhǔn)品），這個功能在確定斜率的重復(fù)性好與Y截距的基礎(chǔ)上完成。對一個標(biāo)準(zhǔn)曲線來說，一個單獨的標(biāo)準(zhǔn)品就已經(jīng)足夠了，也可以在不同的通道甚至一個通道內(nèi)繪制多條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2）相對定量
相對定量是指兩個或更多的基因互相進(jìn)行比較，其結(jié)果是一個比率，沒有確切的數(shù)字被檢測道。一種檢測基因表達(dá)相對定量的方法叫“比較CT值法（⊿⊿Ct）”，這種方法可以徹底不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過觀察與一個動態(tài)相關(guān)對照比較的表達(dá)水平，從而可以將模板與增加的樣品間進(jìn)行相對定量。要使這種方法成功，目的及參照的動態(tài)范圍應(yīng)該相類似。相對的一個敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板濃度，兩個擴(kuò)增子的兩個CT值的差異）隨著不同稀釋度的模板有什么變化。如果兩個擴(kuò)增子的反應(yīng)效率大致相同，則the plot of log input amount versus ⊿Ct 將是一條水平線（斜率<0.01）。這意味著在初始模板濃度范圍內(nèi)，兩個擴(kuò)增子有相同的反應(yīng)效率。如果檢測發(fā)現(xiàn)效率不一致，則應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)曲線來對基因表達(dá)進(jìn)行定量，或優(yōu)化反應(yīng)獲得一個類似的效率。
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