英文標(biāo)題：The tryptophan metabolite 3-hydroxyanthranilic acid alleviates hyperoxia-induced bronchopulmonary dysplasia via inhibiting ferroptosis

中文標(biāo)題：色氨酸代謝產(chǎn)物3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-HAA)通過(guò)抑制鐵死亡緩解高氧誘導(dǎo)的支氣管肺發(fā)育不良

發(fā)表期刊：Redox Biology

影響因子：10.7

客戶(hù)單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院

百趣提供服務(wù)：色氨酸高通量靶標(biāo)代謝組學(xué)、MetPro-Ⅱ代謝物與蛋白相互作用

支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary Dysplasia, BPD)是一種常見(jiàn)于早產(chǎn)兒的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。隨著極早產(chǎn)兒存活率的提升，支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)病率卻居高不下，這嚴(yán)重影響了早產(chǎn)兒的生存率和生活質(zhì)量。探索BPD的潛在機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)新的有效治療策略。

有研究表明，色氨酸代謝物吲哚-3-乙酸在慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)中具有調(diào)節(jié)炎癥、改善肺氣腫和緩解肺功能下降的潛在作用。由于COPD與BPD有一些共同的病理特征，而色氨酸代謝在病理?xiàng)l件下會(huì)受到影響，所以色氨酸及其代謝物是非常有吸引力的診斷、預(yù)后和治療生物標(biāo)志物。此外，色氨酸代謝物的生物學(xué)效應(yīng)及其在疾病中的變化表明，它們可能作為潛在的治療靶點(diǎn)。但目前，色氨酸代謝產(chǎn)物在新生兒BPD中的復(fù)雜功能和機(jī)制仍有待探索。

研究者運(yùn)用UHPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)（由上海百趣生物提供支持），對(duì)BPD嬰兒和非BPD嬰兒的氣管吸出物(Tracheal Aspirates, TAs)中的色氨酸代謝物含量展開(kāi)分析（圖1A）。經(jīng)鑒定，TAs中存在21種代謝物，其中BPD組的3-HAA和ILA相較于對(duì)照組呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（圖1B-C）。

鑒于臨床樣本中這一發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步探究色氨酸代謝失調(diào)是否也存在于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，研究者構(gòu)建了成熟的SD大鼠高氧誘導(dǎo)的BPD模型。與對(duì)照組相比，BPD組的肺泡明顯簡(jiǎn)化，這表明其肺發(fā)育受到了損害（圖1D）。在大鼠實(shí)驗(yàn)中，鑒定出27種代謝物，且肺組織中的代謝物改變更為顯著。其中，BPD組的3-HAA、NAS、5-HTOL較對(duì)照組降低（圖1E-F）。綜上所述，無(wú)論是在BPD組的TA樣本還是肺組織中，3-HAA均出現(xiàn)減少情況，因此后續(xù)圍繞3-HAA展開(kāi)了進(jìn)一步深入研究。

研究者通過(guò)對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行3-HAA的IHC染色（圖 2A），對(duì)肺泡II型上皮細(xì)胞(AECII)進(jìn)行3-HAA的IF染色（圖2G），證實(shí)了體內(nèi)和體外高氧模型中3-HAA的減少。為了研究各組間3-HAA水平差異的根本原因，研究者對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行了3-HAA代謝相關(guān)酶KMO、KYNU和HAAO的WB分析（圖2B-C）和IHC染色（圖2D-F）。結(jié)果表明，BPD組KMO和KYNU蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致3-HAA產(chǎn)生減少，而HAAO蛋白表達(dá)升高導(dǎo)致3-HAA下游代謝增加。此外，AECII的WB分析（圖2H-I）和IF染色（圖2J-L）顯示了類(lèi)似的模式：高氧組KYNU和KMO降低，HAAO升高。RT-qPCR結(jié)果在體內(nèi)和體外高氧模型中也是一致的，為體內(nèi)和體外模型中觀察到的差異提供了合理的解釋。總的來(lái)說(shuō)，BPD與3-HAA降低有關(guān)，這部分是由相關(guān)代謝酶的失調(diào)引起的。

研究者深入探究了補(bǔ)充3-HAA能否緩解高氧誘導(dǎo)的BPD，在為期14天的高氧建模期間，BPD+3-HAA組的大鼠按照特定方案，隔天接受3-HAA霧化處理（圖3A）。結(jié)果顯示，3-HAA霧化展現(xiàn)出良好效果，具體表現(xiàn)為顯著改善了組織病理學(xué)狀況，使得 MLI（平均線性截距）數(shù)值明顯降低（圖3B），這反映出肺泡結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化。同時(shí)，3-HAA霧化有效地提升了體內(nèi)3-HAA的水平（圖3C），為發(fā)揮其保護(hù)作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。尤為關(guān)鍵的是，3-HAA對(duì)高氧處理后的SPC細(xì)胞起到了明顯的保護(hù)作用（圖3D），有助于維持AECII的正常功能。在蛋白水平層面，3-HAA顯著降低了MPO和COX2的表達(dá)，有力地減輕了炎癥反應(yīng)，同時(shí)增加了SPC的表達(dá)，使得AECII損傷得到明顯改善（圖3E）。總體而言，3-HAA通過(guò)改善肺泡復(fù)雜性、抑制炎癥，對(duì)高氧誘導(dǎo)的BPD大鼠模型的肺損傷切實(shí)發(fā)揮了保護(hù)作用。

研究者為了探索3-HAA減輕新生大鼠高氧誘導(dǎo)的BPD的潛在機(jī)制，通過(guò)LiP-SMap方法（MetPro-Ⅱ代謝物與蛋白相互作用，由百趣生物提供）進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究（圖4A）。KEGG通路分析和GO分析富集到一種特定形式的細(xì)胞死亡，稱(chēng)為鐵死亡，這是一種鐵依賴(lài)的，脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的程序性細(xì)胞死亡形式（圖4B-C）。Fe²⁺參與芬頓反應(yīng)，加劇了脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞損傷。富含磷脂的線粒體膜特別容易受到氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙和能量代謝受損。接下來(lái)，研究者通過(guò)評(píng)估鐵死亡相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)、醛和Fe²⁺來(lái)評(píng)估鐵死亡。研究結(jié)果顯示，高氧誘導(dǎo)的BPD導(dǎo)致肺組織中總?cè)嗚F、MDA和4-HNE含量升高，BPD+3-HAA組顯著降低（圖4D）。此外，經(jīng)過(guò)3-HAA處理后，與BPD組相比，長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶4(ACSL4)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、鐵蛋白重鏈1 (FTH1)、核受體共激活因子4(NCOA4) 和微管相關(guān)蛋白輕鏈3B-II(LC3B-II)降低，而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)升高（圖4E）。利用透射電鏡觀察大鼠肺組織AECII的線粒體改變，揭示了典型的鐵死亡相關(guān)變化，如線粒體固縮和嵴丟失，3-HAA治療減弱了這些線粒體異常（圖4F）。綜上所述，3-HAA可抑制高氧誘導(dǎo)的BPD大鼠模型中的鐵死亡，從而減輕肺損傷。

AECII持續(xù)損傷與BPD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織AECII存在線粒體鐵死亡樣變化。研究用CCK-8確定3-HAA、鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和抑制劑DFO的最佳濃度，確定最佳濃度后開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，3-HAA和DFO減弱高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，erastin則逆轉(zhuǎn)3-HAA的作用。在高氧誘導(dǎo)的AECII細(xì)胞模型中，用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)的活性氧(ROS)水平（圖5A）以及用Liperfluo熒光檢測(cè)的脂質(zhì)過(guò)氧化程度（圖5B），與對(duì)照組（C組）相比均顯著升高。補(bǔ)充3-HAA和DFO可減少過(guò)量的ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，而Erastin可逆轉(zhuǎn)這一作用。此外，氧化還原和鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的含量變化也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。例如，F(xiàn)e²?、總?cè)DA和H?O?，在高氧組（H組）和高氧+3-HAA+Erastin組（HAE組）中升高，經(jīng)3-HAA和DFO處理后則降低。同樣地，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平在H組和HAE組中降低，在高氧+3-HAA組（HA組）和高氧+3-HAA+DFO組（HAD組）中升高（圖5C-E）。與H組相比，AECII中FTH1、NCOA4、COX2和LC3B-II的蛋白質(zhì)水平在3-HAA和DFO處理后也降低，而GPX4表達(dá)升高（圖5F）。然而，3-HAA的抗鐵死亡作用被Erastin逆轉(zhuǎn)。由于暴露于高氧環(huán)境，AECII細(xì)胞出現(xiàn)線粒體收縮和線粒體膜密度增加的現(xiàn)象。3-HAA和DFO處理減輕了線粒體的改變，因?yàn)樗鼈冊(cè)陬A(yù)防鐵死亡中起著關(guān)鍵作用。相比之下，Erastin激活了鐵死亡，并阻斷了3-HAA的保護(hù)作用（圖5G）。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，3-HAA減輕了高氧誘導(dǎo)的AECII鐵死亡。

研究者運(yùn)用LiP-SMap方法探尋3-HAA的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)FTH1極有可能是3-HAA的結(jié)合對(duì)象（圖6A） 。為進(jìn)一步明確二者關(guān)聯(lián)，采用表面等離子共振技術(shù)，深入剖析它們之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)與分子親和力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰顯示，3-HAA對(duì)FTH1的親和力呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)特性（圖6B），這表明二者結(jié)合緊密。為直觀展示FTH1與3-HAA的相互作用方式，研究者借助分子對(duì)接技術(shù)，精準(zhǔn)揭示了二者結(jié)合模式（圖6C）。結(jié)果表明，3-HAA巧妙地通過(guò)氫鍵與 FTH1上的SER31和SER59殘基相連。鑒于 NCOA4與FTH1的相互作用在鐵蛋白自噬進(jìn)程中至關(guān)重要，研究者再次運(yùn)用SPR技術(shù)，探究3-HAA是否通過(guò)干擾NCOA4-FTH1相互作用，來(lái)影響鐵蛋白自噬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組的FTH1能夠以高親和力與重組NCoA4蛋白特異性結(jié)合（圖6D） 。然而，當(dāng)體系中引入3-HAA后，F(xiàn)TH1-NCOA4的結(jié)合進(jìn)程被有效阻斷（圖6E）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，研究者開(kāi)展了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，相較于高氧組AECII，經(jīng)3-HAA處理后的細(xì)胞中，NCOA4與FTH1之間的相互作用明顯減弱，在抗NCOA4抗體拉下的免疫沉淀產(chǎn)物中，F(xiàn)TH1的含量顯著減少（圖6F）。綜上，外源性補(bǔ)充3-HAA能夠直接靶向FTH1，通過(guò)破壞NCOA4-FTH1相互作用，有效緩解鐵死亡進(jìn)程，進(jìn)而在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中，顯著抑制高氧誘導(dǎo)的AECII損傷，為BPD的治療提供了全新的理論依據(jù)與潛在靶點(diǎn)。

BPD是需要呼吸支持的早產(chǎn)兒中最常見(jiàn)的慢性肺部疾病。由于缺乏有效的預(yù)防和治療策略，BPD嬰兒的死亡率高于非BPD早產(chǎn)兒，預(yù)后較差，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。了解BPD的潛在發(fā)病機(jī)制對(duì)于制定有針對(duì)性的干預(yù)措施至關(guān)重要。最近的研究強(qiáng)調(diào)了代謝功能障礙在高氧引起的肺損傷中的作用。在本研究中，作者旨在探討色氨酸代謝物在預(yù)防高氧誘導(dǎo)的BPD中的潛在作用，并探討其可能的機(jī)制。

本研究首次揭示了BPD與3-HAA水平顯著降低相關(guān)，表明色氨酸代謝途徑失調(diào)。補(bǔ)充3-HAA通過(guò)靶標(biāo)FTH1抑制鐵死亡途徑，從而減輕大鼠和AECII的高氧誘導(dǎo)損傷。本研究強(qiáng)調(diào)了靶標(biāo)3-HAA和鐵死亡的臨床應(yīng)用潛力，并為BPD的管理和治療提供了新的視角。