上期的蛋白組學(xué)FAQ文章推出后老師們積極關(guān)注，那么這期再給各位老師整理些經(jīng)常咨詢的問題，以供參考。
Q&A
Q1 : 蛋白組一般是建議做多少個生物學(xué)重復(fù)？
A: 原則上是生物學(xué)重復(fù)越多越好，排除個體差異，篩選的差異蛋白更準確，驗證成功率更高。考慮到經(jīng)費、統(tǒng)計分析需要及后續(xù)編輯可能會質(zhì)疑的情況，臨床樣本建議每組十個重復(fù)以上，其他來源樣本每組至少三個重復(fù)。
Q2 : 蛋白組樣本如何寄送？
A: 常規(guī)組織、細胞、體液等生物樣本需要低溫保存，干冰寄送。膠條樣本可以冰袋寄送。
Q3 :蛋白組學(xué)能否測未知的蛋白？或者是表達的外源蛋白，該樣本物種數(shù)據(jù)庫里沒有的蛋白能否測到？
A:蛋白組學(xué)檢測結(jié)果是與已知的數(shù)據(jù)庫蛋白進行比對，無法預(yù)測未知的蛋白，如果需要檢測未知蛋白，可采用測序等其他方法。如果數(shù)據(jù)庫里不包含關(guān)注的蛋白，那么無法比對到。可以將關(guān)注的蛋白序列加入到數(shù)據(jù)庫里作為搜庫文件進行分析。
Q4 :磷酸化蛋白組學(xué)實驗的流程？
A:磷酸化蛋白組可以做非標記產(chǎn)品，也可以做標記產(chǎn)品。目前標記產(chǎn)品做的較多，可以增加檢測深度。實驗流程主要是包括樣本前處理、蛋白的提取、蛋白濃度的測定和跑膠質(zhì)控、酶解成肽段、修飾肽段的富集、（肽段標記）、質(zhì)譜檢測。方案多樣化，可以進行選擇，可以先富集再分級再檢測，或者先標記、分級、每級富集等等。
Q5 :蛋白檢測結(jié)果較少是為什么呢？
A:首先可能是數(shù)據(jù)庫比較小的原因，導(dǎo)致檢測到的結(jié)果比較少。可以選擇擴大層級或者選擇研究較多的近緣物種、模式物種數(shù)據(jù)庫進行搜庫分析。其次看下膠圖，判斷樣本本身條帶是否較少，是否存在高豐度蛋白，高豐度蛋白的存在會影響檢測數(shù)量。
Q6 : 鑒定到的蛋白與凝膠電泳圖譜中估測分子量差異很大的原因？或者為什么SDS-PAGE膠上不同位置條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果中含有同一個蛋白？
A: 由于體內(nèi)或者體外因素，導(dǎo)致同一蛋白存在不同形式的修飾、剪切或者降解，從而形成凝膠電泳圖中能夠看到的存在差異分子量的蛋白條帶。然而這些蛋白在質(zhì)譜鑒定時會同時指向數(shù)據(jù)庫中同一個、全長的、無修飾的蛋白理論序列。因此會出現(xiàn)凝膠電泳圖中的蛋白分子量（實際分子量）與鑒定的蛋白分子量（理論分子量）不同的情況。
Q7 : 差異蛋白如何篩選？
A: 差異蛋白篩選的條件主要是結(jié)合T檢驗的p值和FC值，一般標記產(chǎn)品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非標記產(chǎn)品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05進行篩選。實際過程中也會結(jié)合檢測結(jié)果進行放寬或者卡嚴，一般控制在檢測結(jié)果20%以內(nèi)，5-10%為佳。
Q8 : 做完蛋白組學(xué)，選用何種方法驗證呢？
A: 常規(guī)蛋白驗證方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果關(guān)注的蛋白數(shù)量不多且有對應(yīng)的商品化檢測試劑盒或者抗體，建議選擇ELISA或WB方法進行驗證，此方法更為成熟。如果關(guān)注的蛋白數(shù)量較多，也沒有商品化的抗體，建議選用PRM的方法。經(jīng)費充裕的情況下，抗體制備也是一個不錯的選擇。
Q9 : 通過western blot檢測到的蛋白，為什么質(zhì)譜沒有檢測到或者只檢測到一個肽段？
A: Western blot 檢測是將目的蛋白信號放大很多級之后進行檢測的，靈敏度很高，（除非特異性結(jié)合之外）幾乎不受復(fù)雜樣品中背景蛋白豐度的影響。質(zhì)譜檢測時樣品中豐度較高的蛋白優(yōu)先、多次被檢測到，而豐度較低的蛋白則因為肽段信號過弱被淹沒而不能被檢測到。因此，如果樣品中待檢測的目標蛋白豐度較低，即使WB能夠檢測到，質(zhì)譜并不一定能檢測到或者僅能檢測到較少的肽段數(shù)。
Q10 : 同一批樣本，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下調(diào)，但是蛋白組學(xué)結(jié)果上調(diào)，這種是什么情況？
A: 這是正常的現(xiàn)象，上下游不是一一對應(yīng)的關(guān)系，常規(guī)mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4~0.5。一個蛋白的表達受到很多因素的控制，除了這個蛋白對應(yīng)的mRNA之外，還有比如轉(zhuǎn)錄因子，增強子，抑制子，DNA和RNA的修飾作用等等。
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