nature子刊 (IF=15.7)｜西安交大郭燕教授團(tuán)隊(duì)解析pt-DVT，9種代謝物panel賦能早診，同步挖掘治療關(guān)鍵靶點(diǎn)

英文標(biāo)題：Integrated landscape of plasma metabolism and proteome of patients with post-traumatic deep vein thrombosis

中文標(biāo)題：創(chuàng)傷后深靜脈血栓患者血漿代謝和蛋白質(zhì)組學(xué)的系統(tǒng)分析

發(fā)表期刊：nature communications

影響因子：15.7

客戶(hù)單位：西安交通大學(xué)

百趣提供服務(wù)：新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro

研究背景

深靜脈血栓形成(Deep Vein Thrombosis, DVT)是一種主要的健康問(wèn)題，可導(dǎo)致各種并發(fā)癥，如血栓后綜合征、復(fù)發(fā)性DVT和危及生命的肺栓塞(Pulmonary Embolism, PE)。先前的研究已經(jīng)確定了DVT的多種危險(xiǎn)因素，如高齡、不活動(dòng)、手術(shù)和住院。特別是，創(chuàng)傷個(gè)體繼發(fā)于損傷模式和不活動(dòng)的DVT風(fēng)險(xiǎn)增加。創(chuàng)傷后DVT(post-traumatic DVT, pt-DVT)長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是成人人群中最相關(guān)的臨床問(wèn)題之一，它也是創(chuàng)傷后發(fā)病率和死亡率的主要原因。目前，pt-DVT的診斷依賴(lài)于d-二聚體的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量和超聲的特定成像特征(Ultrasound, US)，但d-二聚體在手術(shù)后或創(chuàng)傷性事件后的DVT風(fēng)險(xiǎn)患者中的應(yīng)用尚不清楚。此外，手術(shù)可能造成繼發(fā)性創(chuàng)傷，創(chuàng)傷患者血栓形成的預(yù)防和早期診斷在住院和圍手術(shù)期護(hù)理中具有挑戰(zhàn)性。因此，識(shí)別pt-DVT的生物標(biāo)志物對(duì)于早期診斷和提供適當(dāng)?shù)腄VT治療是必要和重要的。

為了研究pt-DVT的潛在代謝機(jī)制，并在創(chuàng)傷性骨折患者中識(shí)別DVT患者，研究者使用非靶標(biāo)代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)研究pt-DVT患者和對(duì)照組之間的血漿代謝和蛋白的變化，并篩選與pt-DVT相關(guān)的生物標(biāo)志物。

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研究結(jié)果

2.1 研究隊(duì)列的臨床特征

研究設(shè)計(jì)和分析工作流程如圖1所示。根據(jù)嚴(yán)格的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，共有680名患者被納入發(fā)現(xiàn)(N=580)隊(duì)列和驗(yàn)證(N=100)隊(duì)列。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，從2018年10月至2020年12月招募了252名診斷為偶發(fā)性pt-DVT的患者作為病例，328名未診斷為DVT的患者作為對(duì)照。隨后，從2021年3月至2021年7月，選擇了50名pt-DVT患者和50名對(duì)照組，采用相同的招募標(biāo)準(zhǔn)作為單獨(dú)的驗(yàn)證隊(duì)列。pt-DVT組和對(duì)照組的基本特征大致平衡。

圖1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析流程

2.2 pt-DVT患者的血漿代謝組特征

經(jīng)過(guò)MS/MS鑒定和數(shù)據(jù)過(guò)濾，在所有批次中可重復(fù)檢測(cè)到的326種代謝物被認(rèn)為是穩(wěn)定的，并保留用于后續(xù)分析。通過(guò)正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)對(duì)兩組間的代謝物進(jìn)行分析，鑒定出96種對(duì)差異有顯著貢獻(xiàn)的代謝物（圖2d）。通過(guò)單變量和多變量分析，共有28種代謝物是顯著變化的，并繪制了28種代謝物的聚類(lèi)熱圖（圖2e）。

去偏稀疏偏相關(guān)(Debiased Sparse Partial Correlation, DSPC)網(wǎng)絡(luò)（圖3a）顯示了偏相關(guān)系數(shù)顯著的關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明，不同分類(lèi)間和同一分類(lèi)中代謝物之間存在密集的相互作用，其中脂質(zhì)和氨基酸代謝之間的相互作用最為密集。此外，功能未知的代謝物主要占據(jù)了N2,N2-二甲基鳥(niǎo)苷和丙酮酸這兩個(gè)代謝物附近的位置，這表明它們可能參與了脂質(zhì)、氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代謝。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，一個(gè)高度協(xié)調(diào)的代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是血栓形成的基礎(chǔ)。

圖2.pt-DVT患者和對(duì)照組的代謝譜

圖3.與pt-DVT相關(guān)的多種代謝途徑失調(diào)

2.3 與pt-DVT相關(guān)的多種代謝途徑失調(diào)

通路分析中，研究者發(fā)現(xiàn)了17條涉及氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝的顯著失調(diào)通路（圖3b），表明pt-DVT組存在大規(guī)模代謝失調(diào)。17條顯著改變的通路差異豐度(Differential Abundance, DA)評(píng)分（圖3c）顯示6條參與氨基酸代謝的通路活性升高；與碳水化合物代謝相關(guān)的所有5條通路的活性均顯著上調(diào)，包括已被充分研究的檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和糖酵解/糖異生；而與脂質(zhì)代謝相關(guān)的3條通路的活性均下調(diào)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了一些在pt-DVT中研究較少的氨基酸代謝途徑，如半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等。

2.4 pt-DVT患者CP簇改變

研究者確定了14個(gè)顯著改變的臨床指標(biāo)(Clinical Parameters, CPs)，其中5個(gè)在pt-DVT患者中增加，其他的減少(4a)。Pearson相關(guān)分析顯示CPs顯著增加或減少，并傾向于聚集在一起（圖4b）。有趣的是，功能相似的臨床特征被分組在一個(gè)簇中，如CP最高的簇，包括纖維蛋白原(Fibrinogen, Fbg)、血小板紅細(xì)胞壓積(Platelet Hematocrit, PCT)和血小板計(jì)數(shù)(Platelet Count, PLT)，而降低最多的簇包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Red Blood Cell Count, RBC)、紅細(xì)胞壓積百分比(Hematocrit Percentage, HCT)和血紅蛋白濃度(Hemoglobin Concentration, HGB)。在此基礎(chǔ)上，研究者揭示了pt-DVT的兩個(gè)典型臨床特征，一個(gè)是PLT-PCT-Fbg增加（稱(chēng)為PLT簇），另一個(gè)是RBC-HCT-HGB減少（稱(chēng)為RBC簇）。

研究者進(jìn)一步評(píng)估了這6種CPs在PLT簇和RBC簇中診斷pt-DVT的效果，結(jié)果顯示，PLT和PCT對(duì)pt-DVT具有極好的特異性，可能是有臨床應(yīng)用前景的診斷標(biāo)志物。

圖4.pt-DVT及相關(guān)代謝失調(diào)的臨床差異指標(biāo)

5.代謝組變化與pt-DVT相關(guān)血液特征之間的關(guān)系

通過(guò)計(jì)算代謝物和CPs的Pearson相關(guān)性系數(shù)，發(fā)現(xiàn)18種代謝物與PLT簇相關(guān)，17種代謝物與RBC簇相關(guān)，表明同一簇內(nèi)的CPs具有相似的代謝模式。接下來(lái)，研究者使用線(xiàn)性回歸模型，發(fā)現(xiàn)16種代謝物與PLT簇顯著相關(guān)（圖4c），15種代謝物與RBC簇相關(guān)（圖4d）。研究者進(jìn)一步使用與兩者相關(guān)的代謝物進(jìn)行了基于代謝途徑的富集分析，如圖4e所示，可能調(diào)控PLT簇改變的8條代謝途徑主要涉及脂質(zhì)代謝，尤其是脂肪酸的氧化。在這些途徑中確定了4個(gè)關(guān)鍵代謝物，包括丙酰肉堿、左旋肉堿、5,6-DHET和5-羥色胺。

血漿中丙基肉堿、左旋肉堿和血清素水平升高與PLT、PCT和Fbg水平呈正相關(guān)。此外，有26條代謝途徑與RBC簇相關(guān)（圖4f），包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝途徑等。除脂肪酸氧化和其他與脂質(zhì)代謝相關(guān)的途徑外，咪唑乙酸和丙酮酸水平的升高與血液中紅細(xì)胞數(shù)量、HCT和HGB水平呈負(fù)相關(guān)。它可能通過(guò)碳水化合物和氨基酸代謝，如TCA循環(huán)和糖酵解/糖異生兩種額外的能量代謝，參與pt-DVT的發(fā)病機(jī)制。

6.機(jī)器學(xué)習(xí)識(shí)別pt-DVT血液代謝物的生物標(biāo)志物

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的泛化能力，研究者對(duì)來(lái)自獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列的100名參與者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。如圖5a-b所示，僅使用CPs預(yù)測(cè)pt-DVT的模型1的表現(xiàn)最差，表明目前僅使用CPs可能不足以診斷pt-DVT。相應(yīng)地，模型2（僅代謝物）和模型3（CPs和代謝物）能夠有很好地區(qū)分效果，這表明血漿代謝物在臨床使用中對(duì)pt-DVT的早期診斷和預(yù)測(cè)有很大的貢獻(xiàn)。特別是，包含9種代謝物（十六烷二酸、丙酮酸、L-Carnitine、5 -羥色胺、5,6-DHET、3-羥基癸酸、PE(P−18:1(11Z)/18:2(9Z,12Z))、3-甲氧基苯丙酸和戊腈）（圖5c）的模型2在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中的表現(xiàn)都優(yōu)于其他模型，表明具有更好的可預(yù)測(cè)性和泛化能力。

圖5.機(jī)器學(xué)習(xí)識(shí)別pt-DVT特征代謝物

7.代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了pt-DVT的潛在治療策略

考慮到蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過(guò)分析蛋白的代謝過(guò)程提供深刻的代謝視角，并有助于理解pt-DVT代謝，研究者對(duì)來(lái)自隊(duì)列的96名pt-DVT患者和87名對(duì)照參與者進(jìn)行了一項(xiàng)蛋白組學(xué)研究。總共定性定量了524個(gè)血漿蛋白，214個(gè)蛋白被鑒定為兩組差異蛋白，其中pt-DVT患者中153個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，61個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)（圖6a）。差異蛋白富集的KEGG通路發(fā)現(xiàn)，pt-DVT患者中有15條通路發(fā)生顯著改變（圖6b）。值得注意的是，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)被認(rèn)為是改變最顯著的途徑，這也是直接傳遞到DVT的調(diào)節(jié)途徑。

結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)糖酵解/糖異生在代謝物和蛋白質(zhì)水平上都發(fā)生了變化。糖酵解/糖異生產(chǎn)生丙酮酸用于TCA循環(huán)，而本研究發(fā)現(xiàn)，pt-DVT患者體內(nèi)丙酮酸、檸檬酸和糖酵解/糖異生途徑中的幾種蛋白質(zhì)均顯著增加。因此，有理由推測(cè)，糖酵解/糖異生的上調(diào)可能導(dǎo)致血栓形成的發(fā)病機(jī)制。這促使研究者通過(guò)整合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探索糖酵解/葡萄糖生成的作用。

如圖6c所示，發(fā)現(xiàn)丙酮酸上游的8個(gè)蛋白（LDHA、LDHB、GAPDH、GPI、PKM、MINPP1、ENO1和TPI1）在pt-DVT患者中顯著上調(diào)。丙酮酸級(jí)聯(lián)的糖酵解/糖異生-TCA循環(huán)是產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nictinamide Adenine Dinucleotide, NADH)的主要來(lái)源，在細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。已有研究表明，紅細(xì)胞中的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)會(huì)改變紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并在血栓形成時(shí)影響增強(qiáng)。與這些報(bào)道一致，本研究數(shù)據(jù)表明，ROS相關(guān)的過(guò)氧化物酶在pt-DVT中受到輕微干擾，PRDX5上調(diào)，PRDX2下調(diào)。此外，糖酵解/糖異生途徑中變化最顯著的蛋白乳酸脫氫酶(LDHA/LDHB)，參與多種細(xì)胞的活性氧生成。研究者推測(cè)，糖酵解/糖異生-TCA循環(huán)級(jí)聯(lián)的上調(diào)可能與紅細(xì)胞中ROS的積累有關(guān)，從而增強(qiáng)血栓形成。

總之，代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了干預(yù)糖酵解/糖異生和氧化還原穩(wěn)態(tài)可作為pt-DVT的潛在治療靶點(diǎn)。

圖6.代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了pt-DVT的潛在治療策略

基于這些結(jié)果，研究者還對(duì)數(shù)據(jù)中與糖酵解/糖異生和氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)的蛋白進(jìn)行了藥理學(xué)分析，并確定了50種靶向糖酵解/糖異生和氧化還原穩(wěn)態(tài)的潛在化合物，從而促進(jìn)了后續(xù)的功能研究和藥物開(kāi)發(fā)。

研究結(jié)論

本隊(duì)列研究確定了28種代謝物和14種CPs與pt-DVT顯著相關(guān)，并全面證明了pt-DVT患者血液中代謝和CPs的改變。基于這些顯著改變的代謝物和CPs，研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)由9種代謝物組成的組合，以有效區(qū)分pt-DVT患者。更重要的是，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)丙酮酸級(jí)聯(lián)的糖酵解/糖異生-TCA循環(huán)的上調(diào)可能促進(jìn)血栓形成，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞中的ROS水平。這表明干擾糖酵解/糖異生和氧化還原穩(wěn)態(tài)可能是pt-DVT治療的潛在治療策略。

總的來(lái)說(shuō)，本研究表征了pt-DVT的代謝失調(diào)，并通過(guò)大規(guī)模隊(duì)列確定了血漿生物標(biāo)志物。本研究的發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)pt-DVT的功能研究，并有助于臨床應(yīng)用的早期診斷。

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END

張茗心 撰文

Tang 校稿