題目：Combined spectroelectrochemical and proteomic characterizations of bidirectional Alcaligenes faecalis-electrode electron transfer
期刊：Biosensors and Bioelectronics
影響因子：8.173
合作技術(shù)：SWATH
研究背景
生物電化學(xué)系統(tǒng)可以使用微生物作為生產(chǎn)催化劑。到目前為止，已經(jīng)證明只有少數(shù)微生物可以向細(xì)胞內(nèi)外同時進行電子轉(zhuǎn)移（即雙向電子轉(zhuǎn)移），但是微生物和細(xì)胞外固體之間的電子交換機制仍然不確定。因此，作者選擇Alcaligenes faecalis，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，希望揭示雙向EET的機制。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. A. faecalis 雙向EET特征
圖1顯示了A. faecalis在恒定陽極電位+0.3V的三電極系統(tǒng)中下產(chǎn)生的生物電。經(jīng)過大約一天的滯后，陽極電流急劇增加，在更換陽極介質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)發(fā)電是可重復(fù)的。對于第二和第三循環(huán)（分別為14.2 mAm-2和16.9mAm-2）獲得可比較的最大電流密度，表明外向EET途徑的穩(wěn)定性。同時當(dāng)A. faecalis在-0.5V的恒定陰極電位下生長時，觀察到電子攝取。前三天急劇增加產(chǎn)生負(fù)電流，這說明A. faecalis開始內(nèi)向EET途徑。從第4天到第18天，陰極電流適度波動，最大值為51.8 mAm-2。如此高的電流表明A. faecalis的內(nèi)向EET能力強于其外向能力。作者通過掃描電鏡觀察陽極和陰極生物膜的形態(tài)發(fā)現(xiàn)在陽極和陰極表面均有薄層球狀細(xì)胞分布，這為A. Faecalis和電極之間直接EET提供了可能。
伴隨電子吸收，**鹽逐漸消耗，還原產(chǎn)物積累，N2O和銨（NH4+-N）則為中間產(chǎn)物，而在整個實驗中未檢測到亞**鹽。中間產(chǎn)物表明存在兩種不同的**鹽還原途徑，即反硝化和異化**鹽還原成銨（DNRA）。因此，作者認(rèn)為A. Faecalis利用電極衍生的電子來催化自養(yǎng)反硝化和DNRA。
隨后作者又研究了A. Faecalis生物膜的電化學(xué)活性和電子轉(zhuǎn)移組分。如圖2a和2b所示，陽極和陰極生物膜都顯示出比OCP（開路電位反應(yīng)器）電極更高的催化電流。對于陽極生物膜，CV掃描結(jié)果中出現(xiàn)兩對中點電位（E1/2）（分別為-0.09和-0.32，V vs. SCE）的氧化還原峰，而對于OCP電極沒有觀察到明顯的峰。這兩對電位分別接近枯草芽孢桿菌的細(xì)胞色素c-550(E1/2, ?0.06 V vs. SCE)、膜細(xì)胞色素b554(E0'，?0.31 V vs. SCE) 和甲基萘醌（E0'，- 0.31V vs. SCE）的氧化還原電位。因此，作者認(rèn)為膜細(xì)胞色素或甲基萘醌可能參與外向EET。陽極和陰極氧化還原峰之間的差異表明，外部和內(nèi)部有不同的氧化還原成分。作者為了鑒定氧化還原組分是否位于生物膜或培養(yǎng)基中，通過CV以不同的掃描速率掃描電極生物膜。陽極生物膜在-0.30 V的氧化峰電流隨著掃描速率從1到50 mV / s線性增加，并且在-0.70 V的還原峰處觀察到陰極生物膜的相同趨勢。在圖2c和2d的插圖中顯示的峰值電流高度和掃描速率之間的強線性相關(guān)性（陽極生物膜的R2 = 0.9872，陰極生物膜的R2 = 0.9959）表明典型的表面控制電化學(xué)過程。換句話說，氧化還原組分主要歸因于電極上的生物膜而不是溶液中的溶解物質(zhì)。
圖1 雙向EET比較
圖2 陽極和陰極生物CV掃描結(jié)果
2. 原位EC-FTIRS和電子傳遞抑制劑分析雙向EET途徑
作者又進行了原位EC-FTIRS研究雙向EET的表面氧化還原組分。如圖3a所示，在1248 cm-1和1154cm-1處的條帶為Cyt-c，其強度隨著電極電位的增加而增加，表明Cyt-c可以在高電極電位下被氧化，說明在外向EET期間可以通過Cyt-c向電極轉(zhuǎn)移電子。與陽極生物膜不同，陰極生物膜在1688 cm-1、1580 cm-1、1479 cm-1、1419 cm-1和1328cm-1出現(xiàn)新信號帶。其中1688 cm-1與Cyt-c中β-turn的amide I相關(guān)；1479 cm-1和1580 cm-1與Cyt-c血紅素環(huán)裝基團相關(guān)。值得注意的是1688 cm-1和1479 cm-1處的條帶在陽極生物膜中無顯著性，這些條帶的高強度表明在陰極生物膜中富集了不同的Cyt-c蛋白。綜上說明參與向外和向內(nèi)EET是不同的Cyt-c。
為了研究電子如何在質(zhì)膜中轉(zhuǎn)移，作者用電子傳遞抑制劑分析對A. Faecalis電化學(xué)活性的影響，揭示其雙向EET機制。如圖4a所示，使用0.05mM 抗霉素A（一種阻斷復(fù)合物III中CytbH（細(xì)胞色素c氧化還原酶）和輔酶Q之間電子轉(zhuǎn)移的抗生素）后發(fā)現(xiàn)對外向EET具有較強的抑制作用。相比之下，0.05mM 抗霉素A加入24h之后幾乎完全抑制了內(nèi)向EET，這表明內(nèi)向EET對抗霉素A比對外EET更敏感。加入0.2 mM 阿的平（Quinacrine，阻斷復(fù)合物II（琥珀酸脫氫酶）的FAD和FMN中心）后逐漸抑制向外和向內(nèi)EET，然而內(nèi)向EET的電流在給予阿的平后約12小時開始恢復(fù)，而對外向EET觀察到連續(xù)抑制。增加阿的平量至0.4mM，引起外向EET的完全抑制，0.6mM的阿的平僅在1小時內(nèi)抑制內(nèi)向EET，然后電流逐漸恢復(fù)到其初始值。這表明復(fù)合體II對于向外的EET是必不可少的，但對于向內(nèi)的EET則不是。這種差異反應(yīng)可能是因為FADH2在存在阿的平的情況下不能通過復(fù)合物II向醌池提供電子，因此在外向EET期間沒有再生FAD以維持TCA循環(huán)；相反FADH2可以在向內(nèi)EET期間將電子釋放到還原性TCA循環(huán)中。醌環(huán)抑制劑雙香豆素（0.2mM）和復(fù)合物I（NADH還原酶）抑制劑魚藤酮（0.5mM）對外向EET沒有影響，但顯著抑制內(nèi)向EET。增加魚藤酮的量至1.0 mM后先增強了內(nèi)向EET發(fā)電量，隨后徹底抑制內(nèi)向EET。作者認(rèn)為短時間發(fā)電量增強可能是由于刺激細(xì)菌呼吸產(chǎn)生的。醌環(huán)抑制劑雙香豆素則可以競爭性地抑制電子從復(fù)合物I轉(zhuǎn)移到醌池或反向轉(zhuǎn)移，向外和向內(nèi)EET都被雙胍醇在0.6mM強烈抑制。這些結(jié)果表明細(xì)菌呼吸鏈，即復(fù)合物I、II、III和醌池參與向外和向內(nèi)EET。當(dāng)添加ATP酶抑制劑DCCD（0.3mM）時觀察到類似的抑制作用，它可以與F0F1 ATP酶的c亞基F0的谷氨酸殘基共價結(jié)合從而阻斷質(zhì)子通道。然而，在DCCD存在的情況下，內(nèi)向EET立即停止，而向外EET對DCCD的反應(yīng)相當(dāng)緩慢。這些結(jié)果表明，雙向EET期間的能量增益通過質(zhì)子動力（PMF）來存儲的，而PMF用于ATP合成。
圖3 原位EC-FTIRS結(jié)果
圖4 電子傳遞抑制劑對外向EET（a）和內(nèi)向EET（b）電流的影響
3. 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析雙向EET組件
由于電子傳遞抑制劑實驗只能揭示質(zhì)膜上EET通路的一部分，因此作者進行了A. faecalis生物膜的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，來進一步探討雙向EET機制。作者通過SWATH-MS技術(shù)總共鑒定了1727種蛋白質(zhì)，隨后進行了COG和GO分析，以及不同培養(yǎng)條件（-0.5V、OCP1、+ 0.3V、OCP2）下的蛋白表達水平的層次聚類分析，差異蛋白數(shù)目如表1。作者根據(jù)差異蛋白COG類別對其進行分類，發(fā)現(xiàn)具有最大數(shù)量的上調(diào)蛋白質(zhì)的COG分別為陰極生物膜的“能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化”和陽極生物膜的“無機離子轉(zhuǎn)運和代謝”。這說明BES（生物電化學(xué)系統(tǒng)）中陰極和陽極生物膜的生長速率受到不同代謝過程的限制。KEGG Pathway富集分析結(jié)果顯示在陰極生物膜中有9種通路顯著富集（p <0.05），其中包括CO2固定、TCA循環(huán)和丙酮酸代謝等；而在陽極生物膜中顯著富集到15種通路，如脂肪酸代謝、蛋白運輸?shù)取＿@些結(jié)果表明，在雙向EET期間，A. faecalis的不同KEGG途徑是適應(yīng)性進化的，這不是永久性的，因為這些變化僅限于其代謝而不是基因組。
作者把關(guān)注的重點放在與電子轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白上，與OCP對照相比，細(xì)胞色素c、復(fù)合物I的泛醌氧化還原酶L亞基在陰極和陽極生物膜中均高度表達。這些結(jié)果與觀察到的復(fù)合物I和細(xì)胞色素c在定向EET中的參與一致。在陰極生物膜中，甲酸脫氫酶和亞**氧化還原酶上調(diào)，但在陽極生物膜中下調(diào)，表明這兩種蛋白質(zhì)可能分別在內(nèi)向EET CO2固定和反硝化過程中起重要作用。NADH-醌氧化還原酶亞基N、外膜蛋白（A0A0A2N7I9）、外膜外排蛋白（J0UXU4）、周質(zhì)結(jié)合蛋白（J0JEG5）在陰極生物膜中表達上調(diào)。電子轉(zhuǎn)運蛋白RnfB、氧化還原酶（A0A0A2NEJ3）和細(xì)胞色素c過氧化物酶在陽極生物膜中表達上調(diào)，陰極生物膜中下調(diào)，表明這三種蛋白質(zhì)對外向EET至關(guān)重要，但對內(nèi)向EET則無效。RnfB作為復(fù)合物Rnf的亞基，是與膜相關(guān)的多聚蛋白，它接受來自鐵氧還蛋白的電子并將它們轉(zhuǎn)移到其他Rnf亞基，Rnf復(fù)合物利用釋放的能量將Na+泵出細(xì)胞，電化學(xué)Na+電位的跨膜差異可能驅(qū)動Na+依賴性ATP合成。有研究認(rèn)為鞭毛蛋白的作用與促進生物膜的形成以及電極表面和細(xì)胞之間的通信以及電生成有關(guān)，作者也在本研究中發(fā)現(xiàn)陽極生物膜的鞭毛蛋白（J0ULP1）的高表達，同樣菌毛組裝蛋白CpaB的表達量也發(fā)上調(diào)，說明A. faecalis菌毛可能參與外向EET。CpaB僅在陰極生物膜中略微上調(diào)，表明內(nèi)向EET的電子攝取可能通過與外向EET不同的途徑發(fā)生，外膜蛋白（J0JDR6）在陽極和陰極生物膜中均上調(diào)意味著J0JDR6可能參與雙向EET。
圖5 A. faecalis 蛋白質(zhì)組學(xué)分析
表1 差異蛋白統(tǒng)計（Fold > 2，p < 0.05）
4. 雙向EET模型
作者根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)和電子傳遞抑制劑實驗結(jié)果，提出了雙向EET模型。對于外向EET，從乙酸鹽氧化釋放的電子通過TCA循環(huán)細(xì)菌呼吸鏈細(xì)胞色素-c過氧化物酶或菌毛陽極連續(xù)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生NADH + H+或FADH2，產(chǎn)生質(zhì)子動力（PMF），驅(qū)動ATP合成。另外一種可能則是細(xì)菌呼吸鏈的細(xì)胞色素-c可能首先將電子轉(zhuǎn)移到外膜蛋白，例如J0JDR6，后者通過菌毛直接或間接地向陽極提供電子。對于內(nèi)向EET，細(xì)胞陰極界面處的電子吸收可能通過外膜蛋白進行，電子被周質(zhì)細(xì)胞色素-c接受，隨著PMF的產(chǎn)生，細(xì)胞色素-c向下游提供電子到反硝化的NOx還原酶，同時電子很可能通過PMF的消耗向上傳遞到細(xì)菌呼吸鏈，產(chǎn)生還原能力（NADH和FADH2），還原能力最終用于TCA循環(huán)中以還原CO2。
文章小結(jié)
A. faecalis可催化外向EET發(fā)電和內(nèi)向EET進行自養(yǎng)反硝化。在質(zhì)膜中，向外和向內(nèi)的EET途徑彼此相似，因為復(fù)合物I，II，III和醌池在兩個方向上都參與。但是在周質(zhì)和外膜中，在向外和向內(nèi)EET期間使用不同的氧化還原組分。此外，菌毛蛋白和外膜蛋白分別負(fù)責(zé)EET向外和向內(nèi)的界面?？傮w而言，作者提供了一種用于闡明微生物EET途徑的組合方法。
解析文獻
Linpeng Yu, Yong Yuan，et al. Combined spectroelectrochemical and proteomic characterizations of bidirectional Alcaligenes faecalis-electrode electron transfer. Biosensors & Bioelectronics, 2018 , 106 :21-28.
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