噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展和完善，已被廣泛應(yīng)用于抗原抗體庫(kù)的建立、藥物設(shè)計(jì)、疫苗研究、病原檢測(cè)、基因治療、抗原表位研究及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究等。噬菌體展示系統(tǒng)模擬了自然免疫系統(tǒng)，使我們有可能模擬體內(nèi)抗體生成過程，構(gòu)建高親和力抗體庫(kù)。由于噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的有效轉(zhuǎn)換，使研究者在基因分子克隆基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)構(gòu)象體外控制，從而為獲取具有良好生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物提供了強(qiáng)有力手段。另外，噬菌體展示技術(shù)已成為不經(jīng)過免疫獲取特異性人源抗體的新途徑，為獲取對(duì)人類和動(dòng)物疾病有診斷和治療價(jià)值的單克隆抗體提供了重要手段。
應(yīng)用面這么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下來將由小編為您揭開其神秘的面紗！
一、 噬菌體展示技術(shù)的原理
噬菌體展示技術(shù)（phage display）是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。展示到噬菌體表面的多肽或蛋白保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，可以與靶分子結(jié)合和識(shí)別。噬菌體展示的肽庫(kù)或蛋白庫(kù)與固相抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體，然后用酸堿或者競(jìng)爭(zhēng)的分子洗脫下結(jié)合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴(kuò)增，經(jīng)過3-5輪的富集，逐步提高可以特異性識(shí)別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識(shí)別靶分子的多肽或者蛋白。下圖粗略展示了技術(shù)篩選的過程：
二、噬菌體展示系統(tǒng)的分類
1.M13噬菌體展示系統(tǒng)
M13噬菌體屬于單鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組為6.4 kb，編碼10種蛋白，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，包括主要衣殼蛋白的PⅧ 和次要衣殼的pⅢ 、pⅥ 、PⅦ 和PⅨ 。其中，pⅢ 和PⅧ 是噬菌體展示中最常用的兩種蛋白，構(gòu)建了pⅢ 和PⅧ 展示系統(tǒng)。pⅢ 蛋白分子量為42 kDa，分布在噬菌體顆粒的一端。一般一個(gè)噬菌體有3-5個(gè)拷貝的pⅢ 蛋白，可在N端的柔性連接區(qū)插入外源蛋白或者多肽。pⅢ 系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)展示的外源蛋白大小無嚴(yán)格的要求，該系統(tǒng)可以用來展示分子量較大的蛋白。PⅧ 蛋白的分子量為5.2 kDa，主要分布在噬菌體顆粒的兩側(cè)。由于該蛋白的分子量很小，只適合用來展示外源短肽。外源肽段的太大會(huì)影響病毒包裝，不能形成有功能的噬菌體。但由于pⅢ蛋白拷貝數(shù)較多，該系統(tǒng)比較適合用來篩選低親和力的配體。
2.λ噬菌體展示系統(tǒng)
λ噬菌體是長(zhǎng)尾噬菌體科的一種溫和噬菌體，有直徑55nm的二十面體頭部，末端有細(xì)長(zhǎng)尾絲。基因組為48.5 kb的線性雙鏈DNA分子，有黏性末端即單鏈延伸12個(gè)核苷酸，感染后線性基因組可立即環(huán)化。噬菌體的頭部由D蛋白和V蛋白構(gòu)成，可以構(gòu)建D蛋白和V蛋白的展示系統(tǒng)。λ噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)完成裝配的，無需將外源肽或蛋白分泌到細(xì)菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白質(zhì)(100 kDa以上蛋白質(zhì))及宿主細(xì)胞有毒性的蛋白質(zhì)，適用范圍極廣。
3. T4噬菌體展示系統(tǒng)
T4 噬菌體基因組DNA 為雙鏈線形，呈環(huán)狀排列，噬菌體衣殼的有兩種非必需外殼蛋白：SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)。T4 噬菌體表面展示是將外源多肽或蛋白質(zhì)分別與SOC位點(diǎn)的C末端和HOC 位點(diǎn)的N末端融合而展示于T4 噬菌體表面。T4噬菌體的主要優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)SOC位點(diǎn)和HOC位點(diǎn)同時(shí)展示，展示的拷貝數(shù)也較多。
4. T7噬菌體展示系統(tǒng)
T7 噬菌體基因組為線性雙鏈DNA，其衣殼蛋白通常有兩種形式，即10A(344個(gè)氨基酸殘基)和10B(397個(gè)氨基酸殘基)，10B衣殼蛋白區(qū)存在于噬菌體表面，所以被用來構(gòu)建噬菌體展示系統(tǒng)。T7噬菌體展示系統(tǒng)可以高拷貝展示50個(gè)氨基酸的多肽，以低拷貝量(0.1-1/噬菌體)或以中拷貝量(5-15/噬菌體)展示1200個(gè)氨基酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)。因此，廣泛應(yīng)用于篩選不同分子量，不同親和力的蛋白質(zhì)。
三、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用
1. 抗體篩選
將抗體可變區(qū)的基因插入噬菌體基因組中，表達(dá)的抗體展示到噬菌體的表面，構(gòu)建噬菌體展示抗體庫(kù)，可以在體外模擬抗體生成的過程，篩選針對(duì)任何抗原的抗體。相對(duì)于雜交瘤技術(shù)，通過噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)篩選抗體，可以不經(jīng)過免疫，縮短抗體生產(chǎn)的周期。也可以篩選在體內(nèi)免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗體，適用范圍廣。噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)不受種屬的限制，可以構(gòu)建各種物種的抗體庫(kù)。從人天然庫(kù)中篩選到的抗體，可以不經(jīng)過人源化過程，直接用于抗體藥物研究。
2. 新受體和配體的發(fā)現(xiàn)
將隨機(jī)多肽序列展示到噬菌體的表面，獲得噬菌體展示多肽庫(kù)。用細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)，經(jīng)過差異篩選，獲得出識(shí)別特定細(xì)胞的多肽。通過研究該多肽序列，可以進(jìn)一步得到細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體蛋白。用HCT116細(xì)胞篩選12肽庫(kù)，從庫(kù)中篩選出了可以特異性行識(shí)別結(jié)腸癌細(xì)胞的多肽。進(jìn)一步分析分析發(fā)現(xiàn)，該多肽可以特異性識(shí)別a-enolase。該蛋白有望作為結(jié)腸癌治療的靶標(biāo)，篩選結(jié)腸癌治療藥物。獲得的多肽序列，也可以作為抗癌藥物的運(yùn)送載體。
3. 蛋白質(zhì)相互作用研究
蛋白質(zhì)的相互作用是生命過程中所不可缺少的，噬菌體展示的多肽文庫(kù)是由特定長(zhǎng)度的隨機(jī)短肽序列組成。用靶蛋白質(zhì)(如受體)對(duì)該隨機(jī)文庫(kù)進(jìn)行親和淘選，就可以獲得與之結(jié)合的短肽序列。對(duì)所得序列測(cè)序分析，并合成相應(yīng)的短肽，從而可以來研究?jī)蓚€(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。利用這種方法已經(jīng)成功鑒定出多個(gè)重要大分子，如生長(zhǎng)激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體和TNF-a 受體的激動(dòng)劑和頡頏劑等。
4. 抗原表位分析
用抗體作為篩選的蛋白，從噬菌體展示的隨機(jī)多肽庫(kù)中，篩選出可以與抗體特異性結(jié)合的噬菌體，經(jīng)測(cè)序分析，獲得該抗體識(shí)別的抗原表位。該技術(shù)為抗原抗體反應(yīng)機(jī)制研究，診斷試劑開發(fā)，疫苗制備等提供依據(jù)。
目前的表位鑒定技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)：
①單抗藥物及診斷用單抗的制備；
②研制包括“通用”目標(biāo)在內(nèi)的治療性和預(yù)防性重組多價(jià)肽疫苗；
③研制單表位或重組多表位肽檢測(cè)抗原；
④篩選基于表位基序的疾病、腫瘤等新的特異診斷標(biāo)志物；
⑤高通量發(fā)現(xiàn)同源蛋白中全部保守性和特異性表位；
⑥篩選功能性抗體表位或者抗體中和性及可及性表位；
⑦為表位水平分析病毒遺傳進(jìn)化和變異，提供抗原漂移和轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)。
5. 抗體人源化改造
單抗人源化比例不斷升高，單抗的藥物靶位逐漸多樣化，除了傳統(tǒng)的細(xì)胞表面抗原，還包括了常見的細(xì)胞因子，部分研制中的單抗藥物甚至可以識(shí)別多個(gè)抗原表位，而且單抗藥物的結(jié)構(gòu)也不限于完整的單抗分子。聯(lián)合小分子等的治療方案逐漸增加，日益受到醫(yī)療工作者的重視。因此，作為一種高科技含量的藥物，單抗藥物企業(yè)的科技水平?jīng)Q定了其競(jìng)爭(zhēng)力，也決定了藥物的治療效果和市場(chǎng)價(jià)值。
6. 雙特異性抗體（BsAb）制備
通過基因工程手段將兩個(gè)分別靶向不同抗原的抗體片段組合在一起，具有兩種抗原結(jié)合位點(diǎn)，可以發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)而提高治療效果。但是雙特異性抗體的種類較多，選擇時(shí)根據(jù)最終的應(yīng)用來做判斷。
7. 酶抑制劑篩選
β- 酮脂酰-ACP 還原酶是原核生物脂肪酸生物合成代謝中高度保守和廣泛存在的酶，用此蛋白為篩選的靶蛋白，從噬菌體肽庫(kù)中篩選出了該酶的抑制劑，可以作為新型的抗菌劑。已針對(duì)乙酰膽堿酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰CoA 羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶標(biāo)酶，開發(fā)和研制了一系列高效的殺蟲劑和除草劑。
8. 蛋白質(zhì)的定向改造
蛋白質(zhì)的定向改造是指用盒式突變、錯(cuò)誤傾向PCR等方法來突變蛋白質(zhì)或者結(jié)構(gòu)域的某一特定編碼序列，產(chǎn)生蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的突變文庫(kù)呈現(xiàn)在噬菌體表面，通過親和篩選獲得所需的已定向改變的噬菌體克隆，他們的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以從DNA的序列中推導(dǎo)出來，可用來篩選具有更強(qiáng)受體結(jié)合能力的細(xì)胞因子、新的酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合新位點(diǎn)、新的細(xì)胞因子拮抗劑、新型酶和增強(qiáng)生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)等。
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