重組蛋白、抗體、疫苗、基因治療等生物制品大多來自轉(zhuǎn)基因宿主細胞 (細菌、酵母、動物細胞或人源細胞)的復(fù)雜表達/生產(chǎn)系統(tǒng)，不同宿主的殘留DNA（rDNA）不同，且存在不同片段大小和組成的復(fù)雜陣列，因此風(fēng)險須根據(jù)具體情況評估。

目前關(guān)于rDNA的風(fēng)險研究，主要包括傳染性 (通過病毒，如HIV)，致癌性 (通過癌基因，如Ras)，免疫原性 (通過來自細菌的富含CpG的序列)以及誘變 (通過轉(zhuǎn)座子，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA重組)等，尤其是來自含有致癌或病毒基因的連續(xù)生產(chǎn)細胞系。

雖然動物實驗已顯示外源DNA會誘導(dǎo)腫瘤或傳染風(fēng)險，但沒有直接證據(jù)表明在人體存在同樣風(fēng)險。因此，藥品監(jiān)管機構(gòu)一般允許生物制品中存在10 ng/劑量以下的殘留DNA。此外，根據(jù)雜質(zhì)來源、工藝以及產(chǎn)品類型不同，也會對HCD限度做不同要求。

表1 《中國藥典》關(guān)于生物制品的宿主細胞殘留DNA限度要求

宿主細胞殘留DNA檢測目的與方法

理想的定量檢測方法其靈敏度應(yīng)能檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、基于DNA結(jié)合蛋白的免疫色譜法（閾值法）和定量PCR方法因靈敏度均可達到檢測要求，都屬于經(jīng)典方法。

表2 宿主細胞殘留DNA檢測方法

《美國藥典》和《歐洲藥典》將高靈敏度、高特異性的qPCR法和非序列特異性的DNA結(jié)合蛋白法作為殘留DNA檢測的推薦方法；《中國藥典》則收錄了特異性高的定量PCR法和半定量的DNA探針雜交法以及非序列特異性的熒光染色法。然而，非特異性的DNA檢測結(jié)果不能區(qū)分究竟是生產(chǎn)過程污染、檢測造成的假陽性污染還是工藝缺陷引起的DNA殘余，存在檢測局限性。

影響殘留核酸qPCR檢測的因素

對qPCR檢測方法來說，以下因素對其檢測結(jié)果準確性和方法靈敏度存在較大影響：

• qPCR引物探針的序列特異性

為保證方法高靈敏度和檢出率，用于qPCR檢測的特異序列必須是存在于高度保守區(qū)域內(nèi)的穩(wěn)定序列，并且需要散布在基因組上，保證不會因工藝導(dǎo)致的殘留偏好而引起漏檢。

• 參考品DNA量值溯源及質(zhì)量保證

參考品DNA的量值準確與否，直接關(guān)系到樣品檢測結(jié)果的準確性，因此需制定完善的參考品量值溯源程序，確保結(jié)果準確可靠。參考品DNA的質(zhì)量要求可從條帶大小、完整性、純度、濃度等方面做全面評估，細胞來源的參考品應(yīng)考察支原體污染，質(zhì)粒參考品應(yīng)考察質(zhì)粒宿主E.coli基因組DNA殘留情況等，盡量排除干擾確保結(jié)果準確可靠。

• 前處理過程雜質(zhì)干擾的去除

樣品的前處理操作步驟對DNA檢測結(jié)果的準確度影響較大，通常采用加樣回收試驗來進行驗證并確定可接受的偏離限度，內(nèi)標回收率在50-150%的范圍內(nèi)都可以接受。樣品提取步驟較為復(fù)雜，需要特別注意，操作不當(dāng)不但可能影響回收率還可能引入環(huán)境污染。

• qPCR實驗室能力驗證

為滿足檢測要求，應(yīng)對實驗室硬件和軟件能力進行確認。實驗室設(shè)計應(yīng)按實驗流程分區(qū)操作，每個操作區(qū)域配置相應(yīng)設(shè)施、設(shè)備及耗材，建立實驗室質(zhì)量管理體系，考核實驗人員的操作能力及數(shù)據(jù)分析解讀能力等。

湖州申科自主開發(fā)一系列宿主細胞殘留 DNA、RNA 和片段大小的熒光探針 qPCR 定量檢測試劑盒，以及 特定細胞系定制化試劑盒的開發(fā)、生產(chǎn)和測試，可滿足不同宿主及靶標的檢測需求。核心產(chǎn)品在FDA備案了DMF，多項發(fā)明專利應(yīng)用于藥品法規(guī)的技術(shù)通則，成功支持多家客戶進行中、美、歐的IND及BLA申報。作為專業(yè)領(lǐng)域的國內(nèi)領(lǐng)先企業(yè)，湖州申科憑借數(shù)十種專業(yè)產(chǎn)品、數(shù)百批專用試劑的生產(chǎn)經(jīng)驗，持續(xù)幫助生物醫(yī)藥行業(yè)用戶打造穩(wěn)定、可靠的供應(yīng)鏈。

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