?近期由于新冠病毒Delta突變株在印度、美國、英國、俄羅斯等地區(qū)快速傳播，全球新冠疫情形勢再次惡化，許多國家的每日新增確診病例都創(chuàng)下歷史新高，并且出現(xiàn)了“突破性感染”的病例。所謂“突破性感染”是指個(gè)體在全程接種完疫苗后仍然感染新冠肺炎的現(xiàn)象，即病毒突破了疫苗的防線，造成這種現(xiàn)象的原因之一是患者感染了部分或完全繞過疫苗保護(hù)的突變毒株。
大多數(shù)發(fā)揮中和作用的抗體靶向Spike RBD
首先，為了證實(shí)大多數(shù)發(fā)揮中和作用的抗體是靶向Spike RBD區(qū)域的抗體，這項(xiàng)研究選用了在不同時(shí)間點(diǎn)（癥狀消失后15-121天）采集的來自17個(gè)康復(fù)病人的35份血清樣本，用偶聯(lián)RBD的磁珠捕獲并去除血清中的RBD抗體。研究人員用磁珠法處理前后的血清與Spike RBD或整個(gè)Spike胞外域蛋白分別進(jìn)行ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從而比較RBD抗體剝離前后的血清中和能力。實(shí)驗(yàn)表明，用磁珠法捕獲RBD抗體可以有效去除血清中的RBD抗體，同時(shí)保留靶向其它結(jié)合位點(diǎn)的抗體。如圖1所示，在分離血清中的RBD抗體后，血清與RBD的結(jié)合急劇減少，幾乎完全消失；但與Spike的結(jié)合只減少了一些，說明血清中還有其它抗體存在。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也向我們展示了RBD抗體在血清中總抗占有相當(dāng)?shù)谋壤?/span>
圖1. 磁珠法分離RBD抗體前后（pre vs. post）康復(fù)血清對(duì)RBD（上）和spike（下）的結(jié)合活性。
同時(shí)，研究組測試了這35份血清樣本在RBD抗體剝離前后對(duì)Spike (D614G) 假病毒的中和活性。結(jié)果顯示，在約94%的樣本中，血清的大部分中和活性是由RBD抗體提供的；在超1/3的樣本中，RBD抗體提供了>90%的血清中和活性（圖2）。通過磁珠和假病毒的方法，RBD抗體的關(guān)鍵作用得到驗(yàn)證，因此接下來的研究也聚焦在RBD上的突變。
圖2. 磁珠法分離RBD抗體前后（pre vs. post）35份康復(fù)血清對(duì)Spike(D614G)假病毒的中和抗體滴度（NT50）。實(shí)心球代表抗體分離前；空心球代表抗體分離后；標(biāo)黃代表在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于繪制突變逃逸圖譜的血清樣本。右側(cè)的百分比數(shù)字代表血清總抗中由RBD抗體提供的中和活性。
“逃逸圖譜”揭示導(dǎo)致中和下降的RBD突變
為全面分析所有可能導(dǎo)致抗體中和作用下降的RBD突變，該研究組通過deep-mutational scanning繪制出了RBD的突變圖譜。該方法是通過建立一個(gè)龐大的酵母展示庫，在每個(gè)酵母菌表面展示一種不同的RBD突變蛋白。整個(gè)文庫包括了幾乎所有可能發(fā)生的RBD單點(diǎn)突變。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)使用了康復(fù)后15-61天內(nèi)收集的11份來自不同個(gè)體的血清樣本。經(jīng)D614G假病毒體系驗(yàn)證，這些選取的血清樣本對(duì)RBD都有一定中和作用，其中RBD抗體為總抗提供的中和活性約為63-99%。實(shí)驗(yàn)將酵母展示庫和康復(fù)血清一起孵育反應(yīng)，然后利用熒光激活流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分選并擴(kuò)增對(duì)中和抗體作用呈現(xiàn)顯著逃逸的RBD突變；并用deep sequencing技術(shù)測定某個(gè)特定RBD突變?cè)谛鹿诨蚪M中出現(xiàn)的頻率。
研究組將每個(gè)RBD突變對(duì)血清中和作用的影響定義為該突變的“逃逸系數(shù)（escape fraction）”，這個(gè)系數(shù)越高，逃逸現(xiàn)象越明顯；由此繪制出的“逃逸圖譜（escape maps）”呈現(xiàn)出不同RBD突變的逃逸系數(shù)分布情況。研究組將逃逸系數(shù)高的RBD突變進(jìn)行了分析和歸類，發(fā)現(xiàn)它們可以被主要?jiǎng)澐譃槿瓮怀龅腞BD結(jié)合位點(diǎn)（圖3）：1. Receptor-binding motif（RBM）上的一段receptor-binding ridge；2. 443-450 loop；3. core RBD epitope。RBM上的突變包括E484及發(fā)生在E484附近的L455，F(xiàn)456，G485，F(xiàn)486，F(xiàn)490等。據(jù)報(bào)道，有很多中和活性強(qiáng)的中和抗體靶向443-450這一區(qū)間，包括Regeneron雞尾酒療法中的兩種抗體。Core RBD位于距RBM稍遠(yuǎn)的位置，靶向這一區(qū)域的抗體普遍活性不強(qiáng)，和SARS存在交叉。
圖3. 重要RBD突變位點(diǎn)區(qū)間劃分
面對(duì)突變，康復(fù)者免疫防線變化如何？
為探究康復(fù)者如果二次暴露在突變病毒的風(fēng)險(xiǎn)下，免疫防線將受到怎樣的影響，研究組對(duì)血清抗體活性隨時(shí)間的變化做了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。他們?cè)谏酝淼臅r(shí)間點(diǎn)（康復(fù)后76-121天）再次采集了以上11個(gè)康復(fù)病人的血清，重復(fù)實(shí)驗(yàn)并繪制了逃逸圖譜。結(jié)果顯示，在超半數(shù)樣本中，血清和突變RBD的結(jié)合活性無明顯變化，說明血清抗體的特異性保持不變；但在少數(shù)樣本中，血清隨著時(shí)間過去變得更加廣譜，能夠結(jié)合更多突變RBD；在一例樣本中，F(xiàn)456和E484突變對(duì)血清活性的影響在初期不明顯，但在后期顯現(xiàn)出來。因?yàn)闃颖玖枯^少，無法得出明確結(jié)論，但可以看出病毒突變對(duì)中和抗體免疫防線的弱化作用隨個(gè)體和時(shí)間不同而變化；且有些血清型對(duì)突變有更強(qiáng)的抵抗力。
在大多數(shù)情況下，導(dǎo)致抗體結(jié)合降低的RBD突變也會(huì)降低抗體中和活性，這一點(diǎn)通過spike假病毒中和實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。使中和作用產(chǎn)生最顯著下降的突變是E484（10-60倍），G446（30倍），G485（3-5倍）等（圖4）。在某些樣本中，血清中和抗體對(duì)E484K/E484Q/E484P的中和活性下降可以達(dá)到35-60倍；而10倍左右的下降即相當(dāng)于去除所有血清中RBD抗體的活性損失。
圖4. 假病毒中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同血清型對(duì)不同spike突變的中和作用
上述RBD免疫逃逸位點(diǎn)是否在真實(shí)世界中存在？
圖5. 實(shí)驗(yàn)篩選出的RBD免疫逃逸位點(diǎn)在真實(shí)世界中的突變頻率
總結(jié)
這項(xiàng)研究的關(guān)鍵部分使用了ACROBiosystems提供的預(yù)偶聯(lián)RBD蛋白磁珠（Cat.No.MBS-K002）捕獲血清中的抗體，實(shí)現(xiàn)了快速、徹底的RBD抗體分離。
該款產(chǎn)品是將生物素化的RBD蛋白偶聯(lián)到具有超順磁性的鏈霉親和素 (SA) 磁珠上，利用鏈霉親和素-生物素（SA-Biotin）系統(tǒng)的高結(jié)合親和力（K=10^-15），實(shí)現(xiàn)高效率的抗體捕獲和篩選，幫助研究人員簡便實(shí)驗(yàn)過程、縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)成本，奠定了實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。
除了該款產(chǎn)品，ACROBiosystems基于獨(dú)特的生物素化標(biāo)記蛋白，已推出一系列預(yù)偶聯(lián)新冠抗原的磁珠產(chǎn)品。我們的磁珠由具有超順磁性的微米級(jí)氧化鐵顆粒組成，通過表面偶聯(lián)不同的蛋白，可以特異性結(jié)合不同生物配體并實(shí)現(xiàn)快速、高效的磁性分離。
磁珠的使用步驟十分簡便，通常由孵育、磁分離、洗脫三步組成，只要利用外加磁場就可以進(jìn)行獨(dú)立于生物反應(yīng)的操作，適用于多種實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，例如抗體捕獲/篩選、病毒富集、細(xì)胞分選等。
Immobilized 40 μg SARS-CoV-2 S protein RBD/1 mg beads can bind the Anti-SARS-CoV-2 Spike S1 Antibody with an EC50 of 0.8887 μg/mL (QC tested).
Immobilized 40 μg SARS-CoV-2 S protein RBD/1 mg beads can bind the Human ACE2, Fc Tag (AC2-H5257) with an EC50 of 1.008 μg/mL (QC tested).
The binding curves between SARS-CoV-2 S RBD pre-coupling magnetic beads (Cat. No. MBS-K002) and anti-SARS-CoV-2 S1 antibody after different freeze-thaw cycles.
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參考文獻(xiàn)：
Greaney A. J., Loes A. N., Crawford K. H.D., et al. 2021. Comprehensive mapping of mutations to the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies. Cell Host & Microbe. doi: 10.1016/j.chom.2021.02.003
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