蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）保姆級(jí)教程
Part1：實(shí)驗(yàn)方案
蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白。
我們的Western Blot實(shí)驗(yàn)方案包含蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、檢測(cè)（圖1）及所涉及的試劑，為您的WB實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
圖1、Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟
● 蛋白提取
1、使用Trident Extraction Kits從樣本（細(xì)胞或組織）中提取蛋白。
（注：根據(jù)蛋白與抗體的具體情況優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量以及上樣量）
2、蛋白濃度定量，在-20℃或更低溫度下冷凍保存。
3、在樣品中加入Trident Sample Buffer，100℃煮沸5mins，使蛋白質(zhì)變性；瞬時(shí)離心上樣。
（注：必要時(shí)，使用前在Trident Sample Buffer加入二硫蘇糖醇（DTT）或/3-巰基乙醇（2-ME））
● 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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GTX400005 |
Trident RIPA Lysis Buffer |
100ml |
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GTX400033 |
Trident RIPA Lysis Buffer (Low SOS) |
250ml |
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GTX00835 |
Trident High-Efficiency Exosome Precipitation Reagent |
20ml |
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GTX16357 |
Trident 6x Laemmli SOS Sample Buffer |
25ml |
● SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜
1、將30 µg蛋白或 100 ng純化蛋白裝入SDS-PAGE凝膠孔中。
在SDS-PAGE凝膠孔中加入適量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder（高范圍：GTX50875 或標(biāo)準(zhǔn)范圍：GTX49384）裝入1個(gè)或多個(gè)額外的泳道中。
2、使用1x Running buffer以50-100 V的電壓運(yùn)行1-2小時(shí)。建議將電壓調(diào)低并延長(zhǎng)時(shí)間。可使條帶更清晰，分辨率更高。
3、在Transfer buffer中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或甲醇漂洗過(guò)的PVDF膜上。
（可選：在進(jìn)行下一步之前，通過(guò) Ponceau Red染色確認(rèn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移成功）
● 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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GTX16370 |
Trident 20% SOS (w/v) |
500ml |
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GTX50875 |
Trident Prestained Protein Ladder (High Range) |
500µI |
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GTX49384 |
Trident Prestained Protein Ladder (Standard Range) |
500µI |
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GTX16376 |
Trident Blue Prestained Protein Ladder |
500µI |
● 封閉、孵育抗體、洗膜
1. 封閉：在3%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中封閉30-60分鐘。
2. 一抗孵育：將膜置于含適當(dāng)稀釋一抗的1%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中，在RT下孵育兩小時(shí)或在4°C下過(guò)夜。
3. 洗膜：1x PBST ，一次10分鐘，兩次5分鐘。
4. 二抗孵育：將膜置于含適當(dāng)稀釋二抗的1%脫脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中孵育1小時(shí)。
5. 洗膜：1x PBST ，三次，每次10分鐘。
（注：Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何動(dòng)物血清，適用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF實(shí)驗(yàn)）
● 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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GTX30963 |
Trident Universal Protein Blocking Reagent (animal serum-free) |
100ml |
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GTX30977 |
Trident 10x PBST |
100ml |
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GTX30976 |
Trident 10x TBST |
100ml |
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GTX213110-01 |
Goat Anti-Rabbit lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX213111-01 |
Goat Anti-Mouse lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX224125-01 |
Rabbit Anti-Rat lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX224126-01 |
Rabbit Anti-Chicken lgY antibody (HRP) |
1ml |
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GTX232040-01 |
Donkey Anti-Goat lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX221666-01 |
EasyBlot anti Rabbit lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX221667-01 |
EasyBlot anti Mouse lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628474-01 |
EasyBlot anti Rat lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628547-01 |
EasyBlot anti Goat lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628906-01 |
EasyBlot anti Sheep lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
● 基于ECL成像
按照Trident plus Western HRP Substrate（GTX400006）或Trident femto Western HRP Substrate（GTX14698）來(lái)檢測(cè)信號(hào)。
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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GTX400006 |
Trident plus Western HRP Substrate |
500ml |
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GTX17435 |
Trident pico Western HRP Substrate |
100/500ml |
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GTX14698 |
Trident femto Western HRP Substrate |
100/200ml |
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