你是否經(jīng)歷過這樣的至暗時刻? 顯微鏡下，背景著色比目標抗原還深，非特異性染色如滿天星斗；又或者，心心念念的目標抗原似乎“憑空消失”了，只留下一片蒼白的背景。明明使用了相同的抗體、遵循了相同的實驗步驟，得到的結果卻天差地別。如果你也曾有過這樣的困擾，那么問題或許既不在抗體，也不在于實驗操作，而是出在最初、也最容易被忽視的一步：樣本制備。
Vectorlabs 作為免疫組化、免疫熒光試劑領域的領導者，在本文中系統(tǒng)梳理了一套具備高重復性的IHC樣本制備完整流程。
免疫組化(IHC)樣本制備流程包括：樣本固定、切片、脫蠟復水、抗原修復以及免疫組化筆(PAP)的應用。
圖1：樣本制備流程。
A. 組織保存：石蠟包埋(FFPE)和冷凍保存；
B. 根據(jù)最終應用，組織塊切成不同厚度的切片；
C. 在二甲苯、梯度酒精中進行脫蠟和水化；
D. 熱誘導抗原修復；
E. PAP筆在組織切片周圍畫圈施加疏水屏障，將試劑限制在特定范圍內。
*脫蠟和水化僅適用于FFPE組織切片；
**對于解剖后速凍的組織，可能不需要熱誘導 抗原修復；無論后續(xù)選擇石蠟包埋還是冷凍保存，經(jīng)過福爾馬林固定的標本進行抗原修復都能改善染色。
組織樣本的長期保存主要分為2類：石蠟包埋和冷凍保存
石蠟包埋：?.醛類固定; ?.梯度酒精脫水; ?.二甲苯透明; ?.石蠟浸透。
經(jīng)由福爾馬林固定( 防止組織自溶和腐敗；保存組織形態(tài))；接著，固定的組織經(jīng)過一系列從低濃度到高濃度的梯度酒精處理；然后，與有機溶劑(如二甲苯)孵育去除酒精；最后一步，使用溫熱的石蠟浸透組織，然后冷卻硬化，形成福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊(FFPE)。
冷凍保存：將生物樣本在-20℃或-80℃下冷凍，是保存組織用于IHC應用的另一種選擇。常規(guī)冷凍流程：新鮮組織在液氮、異戊烷或干冰中速凍，用OCT包埋，再用冷凍切片機切片。組織固定通常在切片后進行，固定劑可選擇丙酮、甲醇、乙醇和甲醛等。
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固定劑選擇tips(左圖) |
石蠟包埋和冷凍保存流程圖(右圖) |
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石蠟包埋和冷凍保存對比
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石蠟包埋組織(FFPE) |
新鮮冷凍組織 |
福爾馬林固定冷凍組織 |
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固定時機 |
包埋前 |
切片后 |
冷凍前 |
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固定液 |
甲醛 |
丙酮、甲醇、乙醇等 |
甲醛 |
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包埋/防凍保護 |
石蠟 |
OCT |
冷凍前用防凍劑浸透 |
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保存 |
FFPE塊：室溫下數(shù)年 |
冷凍OCT塊(未固定)：-80°C下約1年 |
若以漂浮切片形式保存，則浸于防凍劑 |
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抗原性 |
可能被固定誘導的交聯(lián)掩蓋 |
保留抗原性，通常不需要抗原修復 |
可能被固定誘導的交聯(lián)掩蓋 |
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切片厚度 |
可薄至1um |
6-10um |
6-20um |
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形態(tài)學 |
保存完好 |
冰晶形成可能影響組織形態(tài) |
保存完好 |
Tips：
快速冷凍樣本是保持組織和細胞形態(tài)的關鍵。如果冷凍速度過慢，會導致大冰晶的形成，從而破壞形態(tài)結構。下面是兩種快速冷凍樣本的方法：
?. 在一個盛有液氮的小型杜瓦瓶中，放入一個裝有異戊烷的金屬容器。用鋁箔紙包裹組織，然后將其浸入冰冷的異戊烷中。
?. 將干冰粉碎并放入一個小型聚苯乙烯泡沫盒(泡沫箱)中。將組織放入盒中，并用粉碎后的干冰將其覆蓋。
組織經(jīng)冷凍或石蠟包埋后，需分別使用冰凍切片機或石蠟切片機進行切片。切片的常規(guī)厚度需根據(jù)最終實驗目的而定。FFPE蠟塊和冷凍組織都適用于制備薄切片和厚切片；但在需要超薄切片(<6μm)的應用中，F(xiàn)FPE蠟塊的切片效果通常優(yōu)于冷凍組織。研究人員可針對不同實驗目的嘗試多種切片厚度，以確定最佳條件。
薄切片：需要高顯微鏡分辨率，且視野內僅需觀察少量細胞時，薄切片是首選；
厚切片(>6μm)：研究腦組織3D形態(tài)或神經(jīng)軸突通路時，可選擇>6μm的厚切片；
超厚切片(20–40μm)：適合細胞體視學定量分析和漂浮切片實驗；
注：較厚的切片可能需要在后續(xù)流程中進行更長時間的孵育；厚冷凍切片可在封閉步驟中加入去污劑以提高組織通透性。
切片完成后，載玻片需要在室溫下自然晾干約24小時，或者在50-60℃的烘箱中烘干1小時，在烘箱中烘干時必須密切留意，因為在高溫下長時間烤片可能會降低免疫原性。有些組織還可以放在50℃恒溫烤片機上加熱30-60分鐘，這樣可以避免樣本從載玻片上脫落。使用化學粘附試劑(如VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion，貨號SP-1800)，有助于組織在原位雜交、高溫抗原修復等嚴苛條件下仍牢固附著在載玻片上。
FFPE樣本切片后需進行脫蠟和水化。這個過程的順序(圖2)與石蠟浸透時的脫水步驟完全相反：
?. 二甲苯脫蠟
?. 梯度酒精復水
圖2. 脫蠟、復水步驟簡易圖
脫蠟不徹底會導致同一樣本中同一 抗原染色出現(xiàn)不均勻或呈斑片狀，使用新鮮配制的試劑是避免這一問題的措施之一。另外，載玻片在每種溶液中浸泡的時間必須適當，且切片越厚所需時間越長；例如，4-5μm的切片完全脫蠟，至少需要2次二甲苯浸泡，每次5分鐘；更厚的切片可延長時間或增加次數(shù)。
福爾馬林固定會使組織蛋白質的氨基酸之間形成交聯(lián)。雖然這一過程對于硬化組織和維持形態(tài)至關重要，但該過程也會掩蓋抗原表位、降低抗原性，導致染色弱或無染色。抗原修復步驟可幫助恢復被掩蓋的表位，從而獲得最佳的染色效果。
熱誘導抗原修復(HIER)：即在特定緩沖液中加熱組織以破壞交聯(lián)(圖3)，相比于酶解法具有明顯的優(yōu)勢。可選擇的加熱設備有微波爐、高壓鍋、水浴鍋或高壓滅菌器，高壓鍋和高壓滅菌器可以在不發(fā)生劇烈沸騰的情況下將樣本加熱至100℃以上，微波爐也具備這個優(yōu)勢，且專業(yè)的實驗室型號可以控制溫度，但需要密切監(jiān)控，并隨時補充蒸發(fā)掉的緩沖液。水浴鍋也能控制溫度，并允許在較低溫度下進行熱誘導抗原修復，這可能非常適合某些特定的應用。無論選擇哪種設備，都需要確定理想的溫度(如果設備允許)和孵育時間。一般的建議是：從低溫開始，根據(jù)需要逐漸升高，并在組織出現(xiàn)損傷跡象之前停止。
溫度對抗原修復效果的影響比緩沖液的選擇更為顯著，緩沖液的pH值同樣重要，檸檬酸鹽和Tris體系溶液是最常用的選擇。選擇修復緩沖液時，可以優(yōu)先參考抗體說明書，無說明書時需自行測試決定。
圖3. 熱誘導抗原修復原理圖
樣本制備的最后一步：使用PAP筆在切片周圍畫疏水屏障圈，能將試劑限制在特定區(qū)域內，避免同張載玻片上多種試劑混合。與傳統(tǒng)PAP筆相比，ImmEdge® PAP筆(貨號H-4000)具備以下特點：
?. 適用于含或不含去污劑(Tween 20、Triton X-100等)的緩沖液，屏障穩(wěn)定
?. 淺藍色疏水圈，清晰可見，兼容酶法與熒光檢測系統(tǒng)
?. 可溶于各類常用透明劑(如二甲苯等)，方便清理
?. 環(huán)保：不含《蒙特利爾議定書》及歐盟理事會認定的破壞臭氧層的物質
規(guī)范的樣本制作，不僅是染色成功的基石，更是確保鏡檢過程順暢無憂的關鍵。每一步選擇都必須貼合實驗需求，任何環(huán)節(jié)操作不當都可能影響結果。唯有前瞻性的全盤考量、科學的決策以及全程使用優(yōu)質試劑，方能確保實驗圓滿成功。
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