熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)通過應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針雜交原理，獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體（或染色體片段）或多種基因狀態(tài)的信息。該技術(shù)具有安全，快速，靈敏度高等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，基因擴(kuò)增、基因定位，基因作圖以及分子診斷等領(lǐng)域。
下面，我們就熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行逐一講解。
取材
取材應(yīng)盡可能新鮮。由于RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞最好在30min內(nèi)固定。
固定
固定的目的是很大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA水平。較常用的固定劑是多聚甲醛，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞。
通透
1、稀酸或酸酐處理
為防止探針與組織中的堿性蛋白之間產(chǎn)生靜電結(jié)合，從而降低背景，雜交前的標(biāo)本可用0.25%的乙酸酐處理，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過乙酰化而被阻斷。組織或細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2M HCl處理，稀酸能使堿性蛋白變性，再結(jié)合蛋白酶消化，可將堿性蛋白去除。
2、去污劑處理
去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，較常用的去污劑是Triton X-100。需要注意的是，過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會(huì)引起靶核酸的丟失。
3、蛋白酶處理
蛋白酶消化能使固定后被遮蔽的靶核酸暴露，從而增加探針與靶核酸的接觸，常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）。
雜交緩沖液孵育
雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育，可以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。
變性
進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的，因此雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性，并且探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。
探針的選擇
選擇探針的基本原則是有高度的特異性。根據(jù)探針的來源可分為，基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長(zhǎng)度，通常在300-1000bp左右，DNA探針在雜交過程中可能會(huì)出現(xiàn)探針雙鏈之間退火，也更容易在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力，RNA探針因其單鏈、高分子結(jié)合力、可適應(yīng)高溫雜交的特性，其檢測(cè)特異性和靈敏度均優(yōu)于DNA探針。寡核苷酸探針的長(zhǎng)度較短，避免了探針內(nèi)部退火的問題，雜交時(shí)的滲透能力也更好。以上每種探針都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇。
探針的長(zhǎng)度、濃度
探針的長(zhǎng)度和濃度也是我們選擇探針時(shí)需要考慮的因素。
1、探針的長(zhǎng)度
一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間，最長(zhǎng)不宜超過400個(gè)堿基。探針過長(zhǎng)，不容易進(jìn)入細(xì)胞；過短，特異性不高。
2、 探針的濃度
探針的濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同，一般為0.5-5.0μg/mL。最適宜的探針濃度要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)才能確定。探針濃度過高會(huì)造成背景染色加深，濃度過低會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)不足。
探針標(biāo)記
這里主要介紹熒光標(biāo)記染料，包括以下幾種：
1、熒光素類染料
熒光素類染料包括標(biāo)準(zhǔn)熒光素及其衍生物，如異硫*酸熒光素（FITC）、羥基熒光素（FAM）、四氯熒光素（TET）等，其中FITC是較常用的一種熒光素染料。
2、羅丹明類染料
羅丹明類染料（rhodamine dye）也是常用的蛋白質(zhì)分析染料之一，主要包括R101、四乙基羅丹明（RB200）和羧基四甲基羅丹明（TAMRA）等。與熒光素類染料相比，羅丹明類具有更強(qiáng)的光穩(wěn)定性、更高的熒光產(chǎn)量和更低的pH敏感性。
3、菁染料
目前應(yīng)用比較廣泛的菁標(biāo)記染料主要有兩類，一類是噻唑橙（thiazole orange, TO）、噁唑橙（oxazole orange, YO）系列及其二聚體染料，另一類是多甲川系列菁染料。
4、其他熒光染料
二苯乙烯、萘酰亞胺、香豆素類、吖啶類、芘類等。
直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針
直標(biāo)型探針是指DNA探針直接與熒光素基團(tuán)共價(jià)連接，間標(biāo)型探針則是指DNA探針先與半抗原（生物素、地高辛）連接，然后半抗原再與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)這種類似“三明治”的復(fù)合物。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性、簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等特點(diǎn)，并且隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也在不斷提高。在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。
雜交溫度、時(shí)間
雜交溫度是雜交能否成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。較佳的措施是使用一些FISH的專用儀器進(jìn)行操作。如果是手工操作，首先需要對(duì)可能使用到的儀器進(jìn)行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內(nèi)）。其次，要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上，這對(duì)于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對(duì)于需要預(yù)熱以達(dá)到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)溫。最后，操作者往往會(huì)忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片，尤其是在冬季，蓋玻片本身的溫度就低，加之探針的量不多，如果沒有事先預(yù)熱蓋玻片就會(huì)使雜交液的溫度急劇下降，嚴(yán)重影響探針和目標(biāo)DNA的雜交效率。
雜交時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響也較大。雜交時(shí)間過短會(huì)造成雜交不完全，過長(zhǎng)則會(huì)增加非特異性雜交。大部分的DNA探針雜交時(shí)間為2-4hr，但是為了穩(wěn)妥起見，一般將反應(yīng)時(shí)間定為16-20hr。雜交反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)當(dāng)與探針的長(zhǎng)度和細(xì)胞通透性有關(guān)，在充分進(jìn)行通透性處理之后，寡核苷酸探針只需要2-6hr便可完成雜交。
降低背景
熒光原位雜交中背景染色是由多種因素造成的，雜交后的洗滌能夠降低背景染色。預(yù)雜交也是降低背景染色的一種有效手段，預(yù)雜交液與雜交液的區(qū)別在于前者不含有探針，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落；硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，減少雜交液的有效容積，從而提高探針的有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的；在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，可以阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，從而減低背景。另外，強(qiáng)烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑，配制后使用pH計(jì)檢測(cè)是否符合要求。每次FISH均使用新的試劑，舊的試劑最好棄置不用。洗脫液和變性液當(dāng)天用當(dāng)天配。最后，防止污染，由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤(180℃)以達(dá)到消除RNA酶的目的。
參考文獻(xiàn)：
江冬瑞, 王弦, 吳強(qiáng). 熒光原位雜交技術(shù)操作的常見問題分析. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志. 2015;31(12):1426-1427.
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