藥物代謝動力學(xué) (Pharmacokinetic, PK) 是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化規(guī)律的一門學(xué)科。血液是藥物及其代謝物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的媒介，各種體液和組織中的藥物濃度與血液中的藥物濃度保持一定的比例關(guān)系，所以血藥濃度變化最具有代表性，是最常用的樣本。為助力抗體藥物臨床前和臨床藥代動力學(xué)研究，設(shè)計一種精準的實驗方法測定血藥濃度就顯得尤為重要。
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目前，最常用的單抗?jié)舛葴y定技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實驗 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)。本文將給大家介紹三種最具代表性的ELISA方法。
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（以PD-1抗體為例）
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案例一、間接法測定PD-1抗體藥血藥濃度 檢測方法：ELISA 檢測儀器：BMG CLARIOstar酶標(biāo)儀 樣本信息：PD-1抗體藥血清樣本 主要試劑： Human PD-1蛋白 (ACROBiosystems, Cat.No.PD1-H5221) Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson, Cat.No. 109-035-098) 簡要流程： 1. 將human PD-1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5221) 以0.1ug/well的濃度包被到板上； 2. 將PD-1抗體藥梯度稀釋到人血清中； 3. 將稀釋過的PD-1抗體藥加到孔板中； 4. 加入Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG二抗； 5. TMB顯色。 檢測結(jié)果： 為避免非特異背景干擾，該方法血清樣本進行了1000倍稀釋，因此血清樣本檢測范圍0.19-6.25ug/mL，檢測靈敏度0.19ug/mL（見圖1）。 圖1. 間接法測定PD-1抗體藥血藥濃度標(biāo)準曲線
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案例二、抗體競爭法測定PD-1抗體藥血藥濃度 檢測方法：ELISA 檢測儀器：BMG CLARIOstar酶標(biāo)儀 樣本信息：PD-1抗體藥血清樣本 主要試劑：ELISA Assay Kit for Anti-PD-1 h-mAb in Human Serum (ACROBiosystems, Cat.No. EPH-V1) 簡要流程： 將human PD-1以0.1ug/well的濃度包被到板上； 將梯度稀釋的PD-1抗體藥和biotinylated anti-PD-1 antibody混合（血清終濃度10%）； 將混合物加到孔板中； 加入Streptavidin Protein, HRP二抗； TMB顯色。 檢測結(jié)果： 該方法血清樣本檢測范圍0.78-25ug/mL，檢測靈敏度0.78ug/mL（見圖2）。 圖2. 抗體競爭法測定PD-1抗體藥血藥濃度標(biāo)準曲線
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案例三、配體競爭法測定PD-1抗體藥血藥濃度 檢測方法：ELISA 檢測儀器：BMG CLARIOstar酶標(biāo)儀 樣本信息：PD-1抗體藥血清樣本 主要試劑： Human PD-L1蛋白 (ACROBiosystems, Cat. No. PD1-H5258) Biotinylated human PD-1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H82F2) Streptavidin Protein, HRP (Thermo, Cat.No. 21126) 簡要流程： 將human PD-L1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5258) 以0.2ug/well的濃度包被到板上； 將梯度稀釋的PD-1抗體藥和biotinylated human PD-1混合（血清終濃度10%）； 將混合物加到孔板中； 加入Streptavidin Protein, HRP二抗； TMB顯色。 檢測結(jié)果： 該方法血清樣本檢測范圍1.565-6.25ug/mL，檢測靈敏度1.565ug/mL（見圖3）。 圖3. 配體競爭法測定PD-1抗體藥血藥濃度標(biāo)準曲線
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圖4. 比較間接法和抗體競爭法檢測不同人給藥前血清樣本中的PD-1抗體濃度。
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案例對比分析 比較上文三個案例，案例三配體競爭法線性范圍較窄，導(dǎo)致樣本稀釋過于繁瑣，且準確性較低。案例一間接法和案例二抗體競爭法相比，線性范圍接近，靈敏度接近。但是，案例一間接法所用二抗為Goat anti-human IgG，在血清中會有非特異性背景干擾，而案例二抗體競爭法使用和生物素結(jié)合的Streptavidin Protein, HRP作為檢測二抗，避免背景干擾（見圖4）。
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為了支持上述研究，ACROBiosystems公司采用案例二的抗體競爭法，開發(fā)了一系列ELISA血藥濃度定量檢測試劑盒，用于測定臨床前和臨床血液樣本中的抗體藥濃度。該系列產(chǎn)品經(jīng)證實具有低背景、通用快速、高批間一致性等卓越的實驗表現(xiàn)。
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低背景 由于血清背景干擾，可能會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此，確定最小稀釋倍數(shù) (MDR) 對實驗至關(guān)重要。實驗過程中需要用緩沖液對樣本進行一定的稀釋，使實驗結(jié)果達到最優(yōu)的精密度，消除基質(zhì)干擾。在間接ELISA中，需要對血清進行1000倍稀釋才能消除假陽性。為了避免過度稀釋產(chǎn)生誤差，ACROBiosystems利用一系列生物素標(biāo)記抗體來降低血清非特異性干擾導(dǎo)致的假陽性。 通用快速 在PD-1血藥濃度檢測試劑盒中，我們成功驗證了五種已經(jīng)上市或臨床階段的治療性PD1抗體。 ? PD-1血藥濃度檢測試劑盒驗證五種治療性PD-1抗體。 ? 我們采用生物素標(biāo)記抗體來和血樣中待測治療用抗體藥物進行專一特異的競爭，避免了常規(guī)夾心法所必須的抗體藥ADA的開發(fā)，極大的縮短血藥濃度分析方法建立的周期。 高批間一致性 高穩(wěn)定性 為確保產(chǎn)品穩(wěn)定性，ACROBiosystems會做加速實驗、凍融實驗和長期穩(wěn)定性實驗來驗證產(chǎn)品穩(wěn)定性。只有經(jīng)過測試證實質(zhì)量和活性沒有任何影響的產(chǎn)品才會被放行。 ? 豐富的產(chǎn)品線
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