ELISA背景介紹
酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種基于抗體-抗原-抗體特異性結(jié)合形成三明治復(fù)合物的高靈敏度、高特異性的免疫檢測(cè)技術(shù)。鑒于其發(fā)展歷史較久，技術(shù)積累成熟，且操作簡(jiǎn)便、成本較低、可高通量檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)（醫(yī)療器械和精密儀器）、生物學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品安全等領(lǐng)域。根據(jù)使用應(yīng)用的需要，可以分為直接法，間接法，夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法等。
根據(jù)ELISA的特點(diǎn)，其常見(jiàn)應(yīng)用有：病毒/細(xì)菌/寄生蟲(chóng)的定性檢測(cè)，蛋白抗原定量，抗體效價(jià)和信號(hào)通路的定性和定量研究；藥物研發(fā)與質(zhì)量控制相關(guān)的血液和組織液中的藥物定量，生物制品的效價(jià)測(cè)定等。
ELISA的顯著特點(diǎn)有：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，精確定量抗原分子濃度；定性篩查樣本中目標(biāo)抗原的存在與否；高通量檢測(cè)大量樣本；檢測(cè)限度達(dá)到ng/mL，pg/mL的高靈敏度分析；以及抗原抗體特異性反應(yīng)的親和能力。
其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線是定量的最終依據(jù)，其主要體現(xiàn)的方面有：1.標(biāo)曲是定量分析的核心依據(jù)，通過(guò)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)出信號(hào)，擬合成數(shù)學(xué)模型，來(lái)反算樣本濃度；2.通過(guò)最低檢測(cè)限和最低定量限，線性范圍和重復(fù)性，來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠；3.根據(jù)斜率和截距判斷獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的正常與否；數(shù)據(jù)可比性和標(biāo)準(zhǔn)化，來(lái)校正數(shù)據(jù)和減少批間差異。
在ELISA檢測(cè)中，Sum of Squares Error (SSE，誤差平方和) 是數(shù)據(jù)分析的重要統(tǒng)計(jì)量，主要用于評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的準(zhǔn)確性以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的離散程度。表示實(shí)際觀測(cè)值（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)）與擬合曲線（如標(biāo)準(zhǔn)曲線）預(yù)測(cè)值之間的偏差平方和。可以評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合優(yōu)度，SSE越小，說(shuō)明實(shí)際數(shù)據(jù)點(diǎn)與擬合曲線的偏差越小，曲線擬合效果越好，反之，提示此次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒磺‘?dāng)；另外，在同一批次ELISA板中，不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的SSE應(yīng)接近，并結(jié)合R²等統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目，來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)條件的重復(fù)性、可靠性和穩(wěn)定性。見(jiàn)圖1，圖2。
ELISA Blank作用
Blank孔不僅直接影響SSE的計(jì)算（校正OD=實(shí)測(cè)OD-Blank OD，Blank孔OD值不穩(wěn)定或異常，會(huì)導(dǎo)致校正后的數(shù)據(jù)偏差增大，從而增加SSE，降低擬合精度。）；Blank孔的較大差異，會(huì)體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差；高Blank信號(hào)導(dǎo)致低濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的計(jì)量為負(fù)數(shù)，扭曲標(biāo)準(zhǔn)曲線，增大SSE。
另外，在《酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，《定量檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估指導(dǎo)原則》，EP17-A2和《Immunoassay Devices Guidance for Industry》中，均提到定量檢測(cè)中的Blank孔，明確要求ELISA實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白孔，并規(guī)定其信號(hào)應(yīng)顯著低于最低校準(zhǔn)品信號(hào)（通常要求Blank OD≤最低校準(zhǔn)品OD的50%）；或者要求空白孔用于確定檢測(cè)限（LOD），其OD值需滿足：均值+2SD≤低濃度校準(zhǔn)品OD值；TMB顯色時(shí)450nm波長(zhǎng)下OD值一般≤0.1；強(qiáng)調(diào)空白孔的重復(fù)性（CV值應(yīng)≤20%）等。
實(shí)際應(yīng)用
因?yàn)槊庖邔?shí)驗(yàn)的所有形式測(cè)量，都需要標(biāo)準(zhǔn)化。所以對(duì)Blank孔的控制是ELISA水平重要的具體體現(xiàn)之一。
賽唐生物歷時(shí)10年，在開(kāi)發(fā)E.coli/CHO/293/SC Yeast/HS Yeast/PP Yeast HCP ELISA過(guò)程中，長(zhǎng)期堅(jiān)持打磨基礎(chǔ)技術(shù)，對(duì)Blank本底進(jìn)行了顯著的控制，下降比例達(dá)10倍。并統(tǒng)計(jì)上百次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Blank從0.1，降低到0.05水平，再到0.01水平(見(jiàn)圖3-圖9)。
與Cygnus相比，本底降低2-10倍，見(jiàn)表1，圖10。為后續(xù)藥物ELISA定量檢測(cè)，提供了扎實(shí)的體系支持。
表1
參考標(biāo)準(zhǔn)
《酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》
《定量檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估指導(dǎo)原則》
《EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline—Second Edition》
《Immunoassay Devices Guidance for Industry》