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來源簡介

     人胚胎腎臟成纖維293細(xì)胞，通常指的是HEK 293，HEK-293，293 cells，都是從1970s的一個受孕女性胚胎中分離得到的永生化細(xì)胞系[1]。
     1973年，來自荷蘭，萊頓的Alex van der Eb實(shí)驗(yàn)室，第一次將腺病毒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)體外培養(yǎng)的293細(xì)胞中。1977年，F(xiàn)rank Graham在McMaster大學(xué)發(fā)表了HEK轉(zhuǎn)染的文獻(xiàn)，因?yàn)榍『肏EK細(xì)胞已經(jīng)傳代了293次，所以就命名為HEK293細(xì)胞。
     一項(xiàng)關(guān)于HEK 293細(xì)胞系及其五個衍生細(xì)胞系的基因組和轉(zhuǎn)錄組的全面研究，將HEK 293的轉(zhuǎn)錄組與人類腎臟、腎上腺、垂體和中樞神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的性質(zhì)與腎上腺更接近[2]。

表達(dá)優(yōu)勢

     經(jīng)過多年的發(fā)展，來源于腎臟的HEK293細(xì)胞發(fā)展成，廣泛應(yīng)用的成纖維型，內(nèi)皮型和上皮型細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)多為三角形或梭形，見圖1。
     使用腺病毒感染HEK293細(xì)胞，經(jīng)過測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)腺病毒約4.5kbp的左臂基因組，整合到了細(xì)胞的19號染色體上[3]。由此，使用腺病毒攜帶不同基因，對HEK293細(xì)胞進(jìn)行改造，生成了適應(yīng)不同藥物的多種細(xì)胞亞株。
     經(jīng)過十年的發(fā)展，目前工業(yè)與科研界已經(jīng)進(jìn)化出了，293f，293T和293S等類型。見圖2。如上述提到的，在1973年，HEK293，可以感染Ad5腺病毒，篩選永生化細(xì)胞；在1984年，HEK293S能夠?qū)崿F(xiàn)MEN培養(yǎng)基的懸浮生長；在1985年，篩選到溫感的SV40 T細(xì)胞大抗原細(xì)胞系，增加了SV40起始子的表達(dá)量；1993年的HEK293H，該細(xì)胞貼壁狀態(tài)下，生長迅速，蛋白表達(dá)水平高，適應(yīng)了serum-free medium；隨后，又衍生出了HEK293FT，一種能夠感染慢病毒的neo抗性突變的細(xì)胞；2014年，優(yōu)化出適合商業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)的HEK293F；期間，HEK293E（EBVA）和HEK2936E，前者能夠表達(dá)EBNA-1蛋白，后者能夠表達(dá)Gly-Gly-Ala重復(fù)區(qū)域缺失的EBNA1t蛋白；還有2001年的HEK293FTM，含有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的FRT位點(diǎn)和TetR質(zhì)粒；還有2002年的HEK293SG，2010年的HEK293SGGD，HEK293A，HEK293MSR等適應(yīng)不同功能和藥物的改造細(xì)胞系。其修飾的靶基因與包括細(xì)胞增殖、凋亡、中心碳代謝、聚糖譜均一性、糖基化效率、蛋白質(zhì)折疊、分泌系統(tǒng)、蛋白質(zhì)表達(dá)等功能相關(guān)。
     目前哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最成熟，最廣泛的仍然是CHO表達(dá)系統(tǒng)。但是對于快速瞬轉(zhuǎn)，人物種翻譯后修飾相似性，還有大分子蛋白復(fù)合物顆粒的表達(dá)，293系統(tǒng)有著核心的優(yōu)勢。所以，293系統(tǒng)仍然是最有應(yīng)用潛力的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)之一。與CHO的表達(dá)優(yōu)勢比較，見下表1：

表1

基因改造

     因?yàn)?93的核心優(yōu)勢，科研與工業(yè)界不斷對293基因組進(jìn)行改造，主要關(guān)注細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖，細(xì)胞中心碳代謝，糖基化，蛋白折疊，蛋白分泌等功能。借助的技術(shù)手段主要是通過miRNA和siRNA為主的敲除和敲降抑制，進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，做合適表達(dá)條件的高通量篩選，見下圖3。

圖3

     基因功能，如Cyclin-dependent kinase like 3 (CDKL3)基因，能夠增強(qiáng)蛋白表達(dá)的，促進(jìn)G1-S轉(zhuǎn)化的細(xì)胞周期基因和促進(jìn)合成功能的Cytochrome c oxidase subunit 15 (COX15)基因。還有一些細(xì)胞生長類的基因，如Cyclin-dependent Kinase inhibitor 2C (CDKN2C)，也是調(diào)節(jié)G1進(jìn)程；抑制細(xì)胞凋亡蛋白合成的B-cell lymphoma 2 (BCL2)基因；降低脫氫酶激酶活性，并增加細(xì)胞質(zhì)中丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化的Dehydrogenase kinase (PDK)。除此之外，還有敲除高甘露糖修飾的MGAT1基因。其中高頻的甘露糖修飾，會增加藥物的那白被修飾的風(fēng)險，且更容易被呈遞給免疫細(xì)胞，增加藥物的體內(nèi)清除可能。相關(guān)基因類型，如下表2所示。

表2

     基于上述HEK293的功能和應(yīng)用潛力，賽唐生物開發(fā)了HEK293 HCP ELISA（HH-H0019-3A1）試劑盒。該試劑盒的DL與QL可以控制在0.39ng/mL和0.78ng/mL。線性表現(xiàn)優(yōu)異80-120%，已經(jīng)證實(shí)可適用樣本為重組單抗，雙抗和病毒包裝樣本。數(shù)據(jù)見下表3：

表3

     同時比較了Cygnus產(chǎn)品，貨號： F650S。在（重組蛋白類型）不同藥物（相同藥物不同純化階段）中的檢出率，有不錯的可比性，見下圖4，5。

                                                  圖4                                                              圖5

     同時，在病毒包裝樣本中，從收獲液，澄清液和病毒濃縮液樣本中，多數(shù)高于Cygnus F650S，并遠(yuǎn)高于國內(nèi)平行產(chǎn)品的檢測結(jié)果。通過ELISA進(jìn)一步驗(yàn)證了客戶HCP清除工藝效率，符合客戶多年純化工藝積淀數(shù)據(jù)。且由于終產(chǎn)物中的HCP識別純度表現(xiàn)優(yōu)異，更容易通過藥監(jiān)局審批。見圖6-9。

                                            圖6                                                                  圖7

                                            圖8                                                                   圖9

     另外，賽唐生物也做了充分的特異性檢測，如核酸酶，胰蛋白酶，BSA，HCP等，極大程度上排除了非特異性識別，見下表4：

表4

     賽唐生物始終堅(jiān)持以解決實(shí)際問題導(dǎo)向，和藥企客戶踏實(shí)走好每一步。“權(quán)威”無法代替技術(shù)去解決實(shí)際問題，“金標(biāo)準(zhǔn)”不是唯一，但更要和藥企一起堅(jiān)持多年的法規(guī)積累，ELISA與LC-MS，二者缺一不可。解決不了ELISA問題，遑論解決以此為基礎(chǔ)的LC-MS鑒定問題？腳下懸空很危險，非此即彼不可取。