急性髓系白血?。ˋML）作為惡性程度最高的血液腫瘤之一，其對(duì)傳統(tǒng)化療及免疫治療的耐藥性問(wèn)題長(zhǎng)期困擾臨床。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)劫持免疫檢查點(diǎn)分子實(shí)現(xiàn)"免疫逃逸"，但針對(duì)AML的特異性免疫抑制機(jī)制仍存在巨大認(rèn)知盲區(qū)。本研究首次揭示，LILRB4/APOE信號(hào)軸通過(guò)重構(gòu)腫瘤微環(huán)境，形成"免疫沉默-代謝重編程"雙重防御體系，為AML精準(zhǔn)治療開(kāi)辟全新路徑。
本研究首次揭示LILRB4通過(guò)"配體-受體-信號(hào)-效應(yīng)"四層架構(gòu)調(diào)控AML免疫逃逸與轉(zhuǎn)移，提出"免疫抑制-代謝重編程"雙軌機(jī)制假說(shuō)。靶向LILRB4的抗體療法在臨床前模型中展現(xiàn)出高效低毒特性，為單核細(xì)胞AML精準(zhǔn)治療提供新策略。相關(guān)成果已申請(qǐng)國(guó)際專利（PCT/US2016/020838），并與Immune-Onc Therapeutics公司達(dá)成轉(zhuǎn)化合作。
研究方法
1. 臨床樣本分析
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利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LILRB4 mRNA表達(dá)水平與AML患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與生存期縮短顯著相關(guān)。
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流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證LILRB4在單核細(xì)胞AML（FAB M4/M5亞型）中特異性高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，且高于正常單核細(xì)胞。
2. 功能驗(yàn)證
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體外實(shí)驗(yàn)：通過(guò)CRISPR/Cas9構(gòu)建LILRB4敲除細(xì)胞系（lilrb4-KO），結(jié)合野生型（WT）及回補(bǔ)細(xì)胞（lilrb4-KO-wt），利用Transwell共培養(yǎng)體系評(píng)估T細(xì)胞增殖抑制能力。
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體內(nèi)模型：建立人源化免疫缺陷小鼠（NSG）及同源小鼠（C57BL/6）異種移植模型，通過(guò)皮下注射或靜脈移植LILRB4敲除/過(guò)表達(dá)的AML細(xì)胞，監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)及T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
3. 機(jī)制解析
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配體鑒定：通過(guò)蛋白液相色譜（FPLC）、質(zhì)譜（MS）及表面等離子共振（SPR）技術(shù)篩選并驗(yàn)證APOE為L(zhǎng)ILRB4特異性配體，結(jié)合常數(shù)（KD）為210 nM。
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信號(hào)通路分析：采用Western blot、免疫沉淀（Co-IP）及RNA測(cè)序（RNA-seq）探究下游信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)LILRB4通過(guò)SHP-2磷酸化激活NF-κB通路，誘導(dǎo)uPAR及ARG1表達(dá)。
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功能挽救實(shí)驗(yàn)：通過(guò)外源性補(bǔ)充APOE、uPAR或ARG1，驗(yàn)證其對(duì)T細(xì)胞抑制及腫瘤浸潤(rùn)的調(diào)控作用。
研究結(jié)果
1. LILRB4表達(dá)與AML預(yù)后及免疫抑制密切相關(guān)
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TCGA數(shù)據(jù)顯示，LILRB4高表達(dá)組患者總生存期顯著縮短（HR=2.34, p=0.0003），且其表達(dá)水平與T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物（PD-1、TIM-3）呈正相關(guān)。
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體外共培養(yǎng)證實(shí)，LILRB4+ AML細(xì)胞通過(guò)胞內(nèi)段傳遞抑制信號(hào)，顯著降低CD8+ T細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌能力。
2. LILRB4通過(guò)APOE介導(dǎo)的信號(hào)軸調(diào)控T細(xì)胞抑制與腫瘤浸潤(rùn)
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配體結(jié)合：APOE通過(guò)其N端結(jié)構(gòu)域與LILRB4的Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活下游SHP-2磷酸化（p-Y580），進(jìn)而促進(jìn)NF-κB入核，上調(diào)uPAR及ARG1表達(dá)。
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功能依賴性：LILRB4敲除顯著抑制THP-1細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移能力（p<0.01），而APOE或uPAR回補(bǔ)可部分恢復(fù)其侵襲表型。
3. 靶向LILRB4的治療潛力
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體內(nèi)驗(yàn)證：抗LILRB4抗體（Fc工程化改造以降低ADCC效應(yīng)）顯著抑制AML異種移植瘤生長(zhǎng)（腫瘤體積減少67%，p<0.001），并延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期（中位生存期從28天延長(zhǎng)至45天）。
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免疫重塑：抗體治療促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)（浸潤(rùn)指數(shù)↑3.2倍），并增強(qiáng)其殺傷活性（顆粒酶B+ T細(xì)胞比例↑40%）。
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安全性評(píng)估：正常造血干細(xì)胞（CD34+）表面LILRB4表達(dá)極低（MFI=12±3 vs. AML細(xì)胞MFI=120±15），抗體處理未影響人源化小鼠骨髓重建效率。
ATHENS為本研究所提供的產(chǎn)品
Athens Research & Biotechnology為本研究提供了多種APO家族蛋白（尤其是重組人APOE），直接支持了LILRB4配體篩選、信號(hào)通路解析及功能驗(yàn)證，是揭示“APOE/LILRB4軸”在白血病免疫逃逸中作用的關(guān)鍵合作伙伴。
具體產(chǎn)品：
APOA1
APOA2
APOA4
APOB
APOC1
APOC2
APOC3
hAPOE
功能用途：
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作為候選配體，通過(guò) 蛋白液相色譜（FPLC） 和 表面等離子共振（SPR） 篩選，驗(yàn)證其與 LILRB4 的結(jié)合能力。
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用于 體外實(shí)驗(yàn) 中模擬生理?xiàng)l件下APOE對(duì)LILRB4的激活作用，證明其通過(guò)特定結(jié)構(gòu)域（如Ig樣結(jié)構(gòu)域）與LILRB4相互作用。
文獻(xiàn)鏈接見(jiàn)原文：http://www.nbs-bio.com/article/2691.html
關(guān)于ATHENS
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