一、初始雜交瘤細(xì)胞篩選（融合后篩選）
- HAT培養(yǎng)基篩選法
- 原理：利用氨基蝶呤阻斷DNA全合成途徑，迫使細(xì)胞依賴次黃嘌呤和胸腺嘧啶（應(yīng)急途徑）。骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT或TK酶無(wú)法存活，僅雜交瘤細(xì)胞能增殖。
- 篩選目標(biāo)：排除未融合的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，保留B細(xì)胞-骨髓瘤雜交瘤細(xì)胞。
二、抗體分泌能力檢測(cè)
- 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
- 操作：將抗原包被于酶標(biāo)板，加入待測(cè)細(xì)胞上清，通過(guò)底物顯色定量檢測(cè)抗體濃度。
- 特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，適用于高通量篩選，可結(jié)合雙抗體夾心法提升靈敏度。
- 免疫熒光（IF）/免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）
- 原理：利用熒光標(biāo)記二抗檢測(cè)抗體與固定細(xì)胞/組織中抗原的結(jié)合，通過(guò)熒光定位判斷抗體特異性。
- 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）
- 應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)胞表面抗原與抗體的結(jié)合，結(jié)合熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平篩選。
三、單克隆化純培養(yǎng)
- 有限稀釋法
- 將細(xì)胞梯度稀釋至每孔0.5-1個(gè)細(xì)胞，通過(guò)多次亞克隆確保單克隆性。
- 半固體培養(yǎng)基篩選
- 在含甲基纖維素的培養(yǎng)基中形成離散克隆，機(jī)械挑取單克隆細(xì)胞群。
- 流式分選技術(shù)
- 通過(guò)熒光標(biāo)記抗體或分泌抗體捕獲技術(shù)（如細(xì)胞膜抗原結(jié)合法）分選目標(biāo)克隆，效率較傳統(tǒng)方法提升10倍以上。
四、高親和力抗體篩選（進(jìn)階）
- 抗原濃度梯度法
- 通過(guò)不同濃度抗原與抗體反應(yīng)的信噪比評(píng)估親和力，信噪比越高提示親和力越強(qiáng)。
- 表面等離子共振技術(shù)（SPR）
- 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體-抗原結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)（如Kd值），量化篩選高親和力抗體。
方法選擇依據(jù)
| 篩選目標(biāo) | 推薦方法 | 優(yōu)勢(shì) |
|---|---|---|
| 初始雜交瘤篩選 | HAT培養(yǎng)基 | 特異性排除非目標(biāo)細(xì)胞 |
| 抗體分泌檢測(cè) | ELISA/流式細(xì)胞術(shù) | 高通量、定量分析 |
| 單克隆純化 | 有限稀釋法+流式分選 | 兼顧成本與效率 |
| 親和力優(yōu)化 | 抗原濃度梯度法+SPR | 精準(zhǔn)評(píng)估結(jié)合特性 |
注：實(shí)際應(yīng)用中常組合多種技術(shù)，如HAT篩選聯(lián)合ELISA檢測(cè)，流式分選輔助單克隆化，以實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的抗體篩選