FITC快速標記及計算（含計算工具）
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產品貨號 |
ARL0021K 系列 |
保存條件 |
-20℃，避光保存 |
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有效期 |
18 個月 |
用途 |
抗體/蛋白/多肽 FITC 標記 |
一、產品概述
本試劑盒用于對含有伯氨基的抗體、蛋白、多肽或其他生物大分子進行 FITC 快速標記。FITC 的異硫氰酸酯基團可與蛋白 N 端氨基及賴氨酸側鏈 ε-氨基反應，形成穩定的硫脲鍵，從而獲得熒光標記產物。
試劑盒配套超濾管、標記緩沖液、助溶劑、清除指示劑和標記物保存液，可完成樣品緩沖液置換、標記反應、游離 FITC 清除與標記物回收。
二、試劑盒組分
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組分 |
小規格 |
中規格 |
大規格 |
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活性 FITC |
2 mg |
4 mg |
6 mg |
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超濾管 |
1 支 |
1 支 |
1 支 |
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FITC 助溶劑（DMSO） |
1.5 mL |
3 mL |
4.5 mL |
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標記緩沖液 |
30 mL |
60 mL |
90 mL |
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清除指示劑 |
1 mL |
2 mL |
3 mL |
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標記物保存液 |
2 mL |
4 mL |
10 mL |
三、型號選擇
根據待標記物分子量和標記體積選擇合適截留分子量與最大體積的超濾管。一般原則：超濾管截留分子量應低于待標記物分子量的1/2，且反應總體積不超過超濾管建議最大體積。
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產品編號 |
最大標記體積 |
待標記物最小分子量 |
可標記抗體量 |
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ARL0021K-3K-0.5mL |
0.5 mL |
3 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-3K-4.0mL |
4.0 mL |
3 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-3K-15mL |
15 mL |
3 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-10K-0.5mL |
0.5 mL |
10 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-10K-4.0mL |
4.0 mL |
10 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-10K-15mL |
15 mL |
10 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-30K-0.5mL |
0.5 mL |
30 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-30K-4.0mL |
4.0 mL |
30 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-30K-15mL |
15 mL |
30 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-50K-0.5mL |
0.5 mL |
50 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-50K-4.0mL |
4.0 mL |
50 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-50K-15mL |
15 mL |
50 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-100K-0.5mL |
0.5 mL |
100 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-100K-4.0mL |
4.0 mL |
100 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-100K-15mL |
15 mL |
100 kDa |
5-300 mg |
四、FITC 用量建議
FITC 標記反應中，真正需要控制的是 FITC 分子數與待標記蛋白分子數的比例。固定“每毫升加 25 μL 或 50 μL”只適合特定蛋白濃度；一旦蛋白濃度改變，實際投料摩爾比也會明顯改變。
4.1 參照體系如何理解
經典 FITC 標記條件中，蛋白溶液建議至少 2 mg/mL；每 1 mL 蛋白溶液加入 50 μL、1 mg/mL 的 FITC 溶液，相當于每毫升反應體系加入約 50 μg FITC。對于 IgG（約 150 kDa）且蛋白濃度為 2 mg/mL 時，該條件折算為 FITC:IgG 約 10:1 的投料摩爾比。
本試劑盒示例中，2 mg/mL IgG 每 1 mL 加入 25 μL、2 mg/mL FITC，實質上同樣是每毫升加入約 50 μg FITC；若按 1 mg IgG、0.5 mL 反應體積計算，則加入 12.5 μL、2 mg/mL FITC，仍對應約 10:1 的投料摩爾比。
4.2 1:20 還是 1:30？取決于蛋白濃度和目標標記強度
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IgG 濃度 |
固定加入 50 μg FITC/mL 時的近似投料比 |
建議用途 |
風險提示 |
建議 |
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2 mg/mL |
約 10:1 |
IgG 常規起始條件 |
通常較穩妥 |
首選起點 |
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1 mg/mL |
約 20:1 |
低濃度樣品或希望提高信號 |
背景可能升高 |
可用，但需驗證背景 |
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0.67 mg/mL |
約 30:1 |
樣品無法濃縮且需要較強信號 |
過標記風險增加 |
謹慎使用，建議小試 |
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<0.5 mg/mL |
>40:1 |
不推薦直接按固定體積加 FITC |
易過標記、回收低 |
優先濃縮或降低 FITC 加量 |
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推薦策略 抗體樣品優先調整到約 2 mg/mL，并以 FITC:IgG 投料比約 10:1 作為首發條件。若信號偏弱，可在小試中提高到 15:1 或 20:1；若背景偏高、親和力下降或功能受影響，則應降低 FITC 加量或縮短反應時間。1:30 并非默認首選，更適合低濃度樣品無法濃縮、且已知背景可控的探索條件。 |
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4.3 通用計算公式
·蛋白量（nmol） = 蛋白質量（mg） ÷ 蛋白分子量（kDa） × 1000
·所需 FITC（nmol） = 蛋白量（nmol） × 目標投料摩爾比
·所需 FITC（μg） = 所需 FITC（nmol） × 389.4 ÷ 1000
·FITC 溶液體積（μL） = 所需 FITC（μg） ÷ FITC 儲備液濃度（mg/mL）
·DMSO 體積分數（%）≈ FITC 溶液體積 ÷（蛋白溶液體積 + FITC 溶液體積）× 100%
說明：1 mg/mL 等于 1 μg/μL，因此 FITC 儲備液濃度以 mg/mL 輸入時，可直接用 μg ÷ mg/mL 得到 μL。
五、實驗前準備
- 提前 20 min 從 -20℃ 取出試劑盒組分，平衡至室溫后使用。FITC 和 FITC 標記產物均需避光操作。
- 用試劑盒提供的助溶劑充分溶解 FITC（建議配成2mg/mL）。建議現配現用；若無法一次用完，應密封避光置于 -20℃，并盡快使用。
- 待標記樣品應盡量去除 Tris、甘氨酸、氨基酸、銨鹽、游離胺類化合物以及其他可競爭伯氨基反應的組分。
- 若樣品含有上述干擾物，先用標記緩沖液通過超濾反復換液；同時可順便濃縮至建議濃度。
- 抗體類樣品建議最終濃度約 2 mg/mL；如濃度較低，應通過計算器重新估算 FITC 用量，避免無意中過量標記。
六、操作步驟（以 1 mg IgG 為例）
1. 樣品換液與濃縮
取 1 mg 待標記 IgG 加入合適截留分子量的超濾管中，加入標記緩沖液至不超過超濾管最大工作體積，12,000 × g 離心 10 min。根據需要重復 2-4 次，最后用標記緩沖液將 IgG 調整至約 2 mg/mL。
2. 加入 FITC
按計算結果加入 FITC 溶液。若使用 1 mg IgG(約 0.5 mLX2 mg/mL )的示例條件，可加入約 12.5 μL 的 2 mg/mL FITC 溶液，對應 FITC:IgG 約 10:1。加入時應緩慢滴加并輕輕混勻，避免局部濃度過高。
3. 避光反應
將反應體系置于 37℃ 避光溫育 60 min 以上。對活性敏感蛋白可降低溫度或縮短反應時間，并通過小試優化。
4. 加入清除指示劑
標記結束后，加入約 1/10 反應體積的清除指示劑，輕輕混勻。該步驟用于輔助判斷游離 FITC 的清除過程。
5. 超濾去除游離 FITC
12,000 × g 離心 10 min，棄去濾液。向超濾管中加入適量標記緩沖液，輕輕吹打混勻后繼續離心。重復洗滌，直至超濾管中基本無藍色殘留。
6. 回收與保存
加入適量標記物保存液或適合樣品的保存緩沖液，輕輕吹打并回收超濾管中的 FITC 標記產物。產物建議 2-8℃ 避光短期保存；長期保存需根據蛋白穩定性加入適合的保護劑，避免反復凍融。
七、FITC 標記產物的 F/P 計算
F/P（Fluorescein/Protein）表示平均每個蛋白分子結合的熒光素分子數。測定時使用石英比色皿或已進行光程校正的讀數，分別讀取標記產物在 280 nm 和 495 nm 的吸光值。A280 建議處于 0.2-1.4 區間；若超出該范圍，應適當稀釋后重新讀數。
7.1 FITC-IgG 產物
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IgG 專用公式 A280,corr = A280 - 0.35 × A495 |
7.2 其他 FITC-蛋白產物
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通用蛋白公式 A280,corr = A280 - 0.35 × A495 |
其中 MW 為蛋白分子量（kDa）；389 為 FITC 分子量；195 為結合態 FITC 在 490 nm、pH 13.0 條件下的 E0.1% 值；E0.1%280 為該蛋白 1.0 mg/mL 時在 280 nm 的吸光值。對于 IgG，常用 E0.1%280 = 1.4。
7.3 結果判讀
F/P < 1：標記偏低或偏保守。若用于直接熒光檢測，可能出現信號不足。
F/P 1–3：溫和標記區間，適合對親和力、構象或功能較敏感的樣品。
F/P 3–6：常用的 FITC-IgG 工藝開發參考區間，通常可在熒光信號和背景之間取得較好平衡。
F/P > 6：高標記區間，信號可能增強，但自淬滅、非特異背景升高、親和力下降或蛋白功能受影響的風險增加。
八、常見問題與優化建議
為什么同樣加 12.5 μL FITC，有的樣品背景高？
因為樣品濃度、分子量和可反應氨基數量不同。固定體積并不等于固定投料摩爾比。低濃度樣品若仍按固定體積加入 FITC，實際投料比會顯著升高。
能否直接使用 1:30？
可以作為探索條件，但不建議作為所有抗體的默認條件。對于 IgG，1:30 更適合低濃度樣品或需要增強信號的小試；若用于常規 2 mg/mL IgG，可能增加過標記風險。
標記后為什么一定要去除游離 FITC？
游離 FITC 會造成高背景、假陽性信號和保存穩定性問題。超濾清除至指示顏色消失后，仍建議根據實驗靈敏度適當增加洗滌次數。
結果 F/P 合適就一定好用嗎？
不一定。F/P 是質量控制指標之一，最終仍需用 ELISA、流式、免疫熒光、WB 或功能實驗驗證信號強度、背景和特異性。
* 本產品僅供科研使用，不用于臨床診斷或治療。