PUREfrex®2.1于2017年推出，與2.0的版本相比，PUREfrex®2.1可以選擇不同的還原劑，同時(shí)保留PUREfrex ®2.0反應(yīng)溶液的成分，可根據(jù)需求選擇更合適的蛋白合成條件。
二硫鍵的形成對(duì)于分泌蛋白如酶或抗體的折疊和穩(wěn)定性具有重要的作用。二硫鍵通常由相鄰半胱氨酸殘基的巰基(SH-)氧化形成。因此，二硫鍵的形成效率取決于氧化還原狀態(tài)。此外，能夠催化二硫鍵交換的二硫鍵異構(gòu)酶也是正確配對(duì)半胱氨酸所必需的。
PUREfrex®反應(yīng)混合物中的氧化還原狀態(tài)受還原劑類型以及還原劑和氧化劑比例的影響。PUREfrex 2.0的溶液I中含有二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑。PUREfrex 2.1的溶液I中不含還原劑，您可以為自己感興趣的蛋白質(zhì)選擇合適的還原劑。PUREfrex 2.1的溶液I中既沒(méi)有DTT也沒(méi)有半胱氨酸。半胱氨酸、DTT和還原型谷胱甘肽(GSH)分別獨(dú)立包裝提供。您也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求使用其他還原劑，例如2-巰基乙醇（未提供）。
圖2.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分對(duì)比
PUREfrex®2.1使用方法：
以20ul反應(yīng)體系為例，如果需要擴(kuò)大體積可以等比例增加對(duì)應(yīng)試劑。以下是合成含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方案，合成含有二硫鍵的蛋白需要搭配DsbC Set（該套裝包含GSSG 和 DsbC），合成沒(méi)有二硫鍵的蛋白時(shí)，用DTT來(lái)代替GSH，不需要使用DsbC Set。
1. 將溶液I，Cysteine, GSH和 GSSG在室溫或37℃下加熱1分鐘至完全融解，然后在冰上冷卻。
2. 在冰上融化溶液II，溶液III和DsbC。
3. 將每種溶液渦旋后離心收集管底內(nèi)容物。
4. 根據(jù)下列表格配置反應(yīng)液，每1kb加入模板DNA 1-3ng/ul。（注意:在PUREfrex® 2.1中，可以自由調(diào)節(jié)還原劑(例如：Cysteine、DTT和GSH)等的量，但是一定要加Cysteine，Cysteine是合成蛋白質(zhì)的原料。）
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Water |
5-X μL |
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Solution I |
8μL *1 |
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10 mM Cysteine *2 |
1μL |
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80 mM GSH *2 |
1μL |
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60 mM GSSG |
1μL |
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Solution II |
1μL |
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Solution III |
2μL |
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80 µM DsbC *3 |
1μL |
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Template DNA *4 |
X μL |
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總體積 |
20ul |
5. 在37°C的heat block或水浴中反應(yīng) 2~6 h，合成蛋白。注意：蛋白質(zhì)合成反應(yīng)通常最長(zhǎng)到6小時(shí)，但是一些蛋白質(zhì)需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間(例如24小時(shí))以在正確的半胱氨酸殘基對(duì)之間形成二硫鍵。
6. 分析合成蛋白。
注釋：*1. 使用量與PUREfrex ® 2.0 不同。
*2. 可以自由調(diào)節(jié)還原劑（半胱氨酸、DTT和GSH等）的量，但一定要添加半胱氨酸。
*3. 使用DsbC Set中包含的稀釋緩沖液稀釋DsbC。
*4. 模板DNA的制備請(qǐng)參考：https://purefrex.genefrontier.com/resources/tech_notes/template-dna-preparation.html/
試劑盒組分（各溶液成分保密）：
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組分名稱 |
250 μL規(guī)格 |
2 mL x 5規(guī)格 |
組分內(nèi)容 |
保存溫度 |
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Solution I |
100 μL |
800 μL x 5 |
Amino acids, NTPs, tRNAs and substrates for enzymes etc. |
-20℃ |
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Solution II |
12.5 μL |
100 μL x 5 |
Proteins in 30 % glycerol buffer |
-20℃/-80℃ |
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Solution III |
25 μL |
200 μL x 5 |
Ribosome (20 μM) |
-80℃ |
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Cysteine |
20 μL |
160 μL x 5 |
Cysteine (10 mM) |
-20℃ |
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DTT |
20 μL |
160 μL x 5 |
Dithiothreitol (40 mM) |
-20℃ |
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GSH |
20 μL |
160 μL x 5 |
Reduced glutathione (80 mM) |
-20℃ |
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DHFR DNA |
10 μL |
10 μL x 1 |
PCR product containing a gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR) from E.coli as a positive control. (20 ng/μL) |
-20℃ |
請(qǐng)注意：1.上表中的保存溫度為試劑盒開(kāi)封后的保存溫度，打開(kāi)試劑盒之前請(qǐng)將試劑盒儲(chǔ)存在-80℃的溫度下。2.剩余的反應(yīng)溶液儲(chǔ)存在-80℃前使用液氮或干冰/乙醇等進(jìn)行速凍。請(qǐng)根據(jù)需求進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融。3. 合成DHFR時(shí)，請(qǐng)?jiān)?0 µL合成反應(yīng)溶液中添加1 µL DHFR DNA。
產(chǎn)品信息：
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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GFK-PF213-0.25-EX |
PUREfrex®2.1 |
1 x 250 µl |
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GFK-PF213-2ML-EX |
2ml |
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GFK-PF213-10ML-EX |
5 x 2 ml |
當(dāng)您的蛋白質(zhì)需要分子伴侶的幫助或形成二硫鍵以形成正確的構(gòu)象時(shí)，只需向PUREfrex®2.1中添加補(bǔ)充試劑即可。
分子伴侶-幫助蛋白正確折疊，合成可溶形式蛋白質(zhì)
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產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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GFK-PF003-0.5-EX |
DnaK Mix |
500 µl Equivalents |
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GFK-PF003-10ML-EX |
DnaK Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
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GFK-PF004-0.5-EX |
GroE Mix |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF004-10ML-EX |
GroE Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
幫助形成二硫鍵的添加物
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產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
|
GFK-PF005-0.5-EX |
DsbC Set |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF005-10ML-EX |
DsbC Set |
5 x 2 ml Equivalents |
|
GFK-PF006-0.5-EX |
PDI Set |
500 µl Equivalents |
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GFK-PF006-10ML-EX |
PDI Set |
5 x 2 ml Equivalents |
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