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冠狀病毒包含E (envelope protein)、M (membrane protein)、N (nucleocapsid protein)和S (spike protein)四種典型結(jié)構(gòu)蛋白。其中，S蛋白包含S1和S2兩個功能性亞基，S1負責與宿主細胞受體結(jié)合，S2負責將S蛋白錨定在病毒膜上并介導病毒膜與宿主細胞膜的融合。所以S蛋白是介導冠狀病毒進入宿主細胞的主要蛋白，也是感染后引起宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和性抗體的主要靶標。

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S蛋白在冠狀病毒的表面會形成突出的同型三聚體，2020年2月份Science重磅報道了2019-nCoV S蛋白三聚體的cyro-EM結(jié)構(gòu)，不僅為解釋2019-nCoV S蛋白與ACE2蛋白的親和力比SARS S高10-20倍提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)，也進一步闡釋了S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)對于介導冠狀病毒進入宿主細胞的重要作用。與SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白類似，2019-nCoV S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)中，每一個S蛋白單體與相鄰的S蛋白相互纏繞形成緊湊的mushroom-shaped同型三聚體，其中S1亞基的SD1/SD2 domain與相鄰S的S2亞基相互作用，這種相互纏繞的模式使得S1形成類似冠狀的結(jié)構(gòu)從而將S2 trimer鎖定在prefusion的狀態(tài)（如Fig.1），而S1 RBD與受體ACE2的結(jié)合以及S1/S2邊界處的酶切斷裂，都會使S1三聚體冠狀結(jié)構(gòu)移除，從而造成S2大規(guī)模的構(gòu)象變化，進而導致病毒膜與宿主膜融合(Fig.2)。可以說，S蛋白的trimer結(jié)構(gòu)對于穩(wěn)定S2 trimer prefusion的構(gòu)象至關(guān)重要，也會直接影響其與ACE2蛋白的結(jié)合活性。

Fig.1 Front and top view of the trimeric coronavirus spike protein ectodomain obtained by cryo-electron microscopy analysis. Three S1 protomers (surface presentation) are colored in red, blue, and green. The S2 trimer (cartoon presentation) is colored in light orange.

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Fig.2 Schematic of 2019-nCoV S primary structure(colored by domain) and A single promoter of 2019-nCoV S with the RBD in the down (left) and up conformation(right).

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因此，具有正確結(jié)構(gòu)的三聚體S蛋白對于抗病毒藥物的開發(fā)具有重要意義，重組表達S蛋白產(chǎn)品在研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控過程中需要對其分子量進行準確測定，證明S蛋白在生理溶液中是以正確的天然三聚體狀態(tài)存在，保證其應(yīng)有的正確結(jié)構(gòu)和功能。

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常見的蛋白分子量測定技術(shù)有相對定量法 (SEC-HPLC，高效分子篩液相色譜) 和絕對定量法（SEC-MALS，多角度激光散射），兩種技術(shù)都可以方便的測定溶液中生理條件下蛋白的分子量，但由于原理上的不同，導致檢測結(jié)果準確度存在顯著差異 (表1) 。SEC-HPLC需要借助標準蛋白進行分子量內(nèi)插測定，實際應(yīng)用中常常受到多種因素的干擾，無法準確得到蛋白質(zhì)真實分子量和聚集狀態(tài)。MALS技術(shù) (Multi-Angle Light Scattering) 是基于蛋白的分子量與光散射的強度直接相關(guān)來測定蛋白絕對分子量的技術(shù)，無需使用標準蛋白，不依賴于洗脫保留時間，也就避免了SEC分子篩測定分子量的諸多問題。SEC-MALS技術(shù)中，通過SEC分離后的各組份進入多角光散射檢測器，激光照射到分析物時會發(fā)生光的散射，MALS通過多個角度同時測定散射光的強度 (Fig.3a) 。從公式b1中 (Fig.3b1) 可以看出散射光強度正比于摩爾質(zhì)量、濃度、折光指數(shù)增量的平方，用公式b2（Fig.3b2）可以直接計算出分析物的絕對分子量。由此可見，MALS技術(shù)不依賴于蛋白的洗脫保留時間來計算蛋白分子量，因此測定結(jié)果較傳統(tǒng)的SEC-HPLC更加準確可靠。

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表1. SEC-HPLC和SEC-MALS兩種檢測方法的比較

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基于SEC-MALS方法的獨特優(yōu)勢，ACROBiosystems獨家推出以正確三聚體形式存在的高活性S蛋白，并使用SEC-MALS技術(shù)對蛋白的分子量和聚體形式進行了嚴格驗證。結(jié)果顯示，全長三聚體S蛋白在溶液生理條件下以正確的三聚體形式存在，且三聚體含量達到85%以上，同時，經(jīng)SPR驗證ACE2親和力為35nM，ELISA中EC50為0.2nM，具有非常理想的天然活性。

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天然三聚體S活性蛋白的上市，有助于更加深入地理解病毒感染機理，為快速藥物篩選和藥物開發(fā)提供有力的支持。

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2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (MALS verified)

SPN-C52H8

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全長三聚體S蛋白與ACE2蛋白結(jié)合活性：親和力常數(shù)35.3 nM (SPR）

Human ACE2, Fc Tag (Cat. No. AC2-H5257) Captured on CM5 chip via anti-human IgG Fc antibodies surface can bind 2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (Cat. No. SPN-C52H8) with an affinity constant of 35.3 nM as determined in a SPR assay (Biacore 8K).

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全長三聚體S蛋白與ACE2蛋白結(jié)合活性：EC50為0.2 nM (ELISA）

Immobilized Biotinylated Human ACE2 / ACEH Protein, Fc, Avi tag? (Cat. No. AC2-H82F9) at 1 μg/mL (100 μL/well) on streptavidin precoated (0.5 μg SA/well) plate, can bind 2019-nCoV (COVID-19) Full Length S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (Cat. No. SPN-C52H8) with a linear range of 1-20 ng/mL.

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產(chǎn)品列表

（2019-nCoV Inhibitor Screening Kit即將面市，敬請關(guān)注，歡迎預(yù)購！

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參考資料

1. Wrapp D, et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike prefusion conformation. Science. 2020 Mar.

2. R.J.G. Hulswit, et al., Coronavirus Spike Protein and Tropism Changes. Advances in Virus Research. 2016 Aug.