在 ADC研發進程中，內吞檢測是驗證候選抗體活性、保障藥物療效的關鍵環節 —— 您是否正被這些問題困擾：
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檢測信號弱到無法區分內化水平？
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方法單一難以適配多場景驗證？
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試劑批間差異大導致重復實驗成本高？
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活動時間：10月29日 — 11月30日
參與人群：中國大陸生物醫藥領域終端用戶
參與方式：掃描下方【二維碼】立即參與
針對ADC內吞檢測，目前的檢測試劑通常存在信噪比較高的問題——這不僅會掩蓋真實內吞信號，還會導致我們無法區分內吞水平不同的候選藥物。
為解決以上問題，ACROBiosystems百普賽斯開發并驗證了一種利用pH敏感的內吞檢測試劑(Cat. No. IGG-PZF2001)，適用于快速評估抗體的內吞過程。該試劑具有高信噪比的特點以及能夠幫助我們獲得更大的檢測窗口。在流式細胞術（FACS）和細胞成像實驗中，較傳統試劑檢測靈敏度更高，能捕捉微弱內化信號。
我們通過熒光顯微鏡成像和流式細胞術，利用該試劑評估HER2陽性貼壁細胞和CD20 陽性懸浮細胞中的抗體內化水平，探究了試劑濃度、孵育時間等關鍵實驗參數，并評估了這些參數對熒光信號和內吞效率的影響。
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內吞檢測試劑特異性驗證
檢測方法：熒光顯微鏡成像
檢測儀器：EVOS M7000 成像系統
細胞：SK-BR-3
檢測結果：
熒光顯微鏡觀察顯示，僅實驗組細胞的內體區室中出現強熒光信號（圖1C）；而對照組（無抗體組或加入同型對照抗體組）僅呈現極低水平的背景信號（圖1A-B）。這種依賴抗體的熒光分布模式清晰表明，內吞作用信號是由靶標抗體結合特異性介導產生的。Z 軸堆疊掃描進一步證實了這一結論：結果顯示內吞作用試劑信號（紅色）與溶酶體標志物（綠色）存在高度共定位，且未檢測到細胞外信號（圖 1D）。
圖1 A:內吞作用檢測試劑（貨號：IGG-PZF2001）;B:IgG1 同型對照抗體 - 內吞作用檢測試劑偶聯物;C:抗 HER2 抗體 - 內吞作用檢測試劑偶聯物;D:抗 HER2 抗體 - 內吞作用檢測試劑偶聯物（Z 軸堆疊掃描成像）
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流式細胞術檢測ADC內吞作用
此外，我們在 HER2 陽性和 CD20 陽性兩種細胞系中均開展了流式細胞術分析。
檢測方法：流式細胞術
檢測儀器：BD Biosciences FACS Lyric
細胞：SK-BR-3、Raji
主要試劑：
圖2 抗體內吞作用的流式細胞術（FACS）分析：A. HER2 陽性細胞系中 HER2 特異性抗體曲妥珠單抗（紅色）的檢測結果B. CD20 陽性細胞系中 CD20 特異性抗體利妥昔單抗（紅色）的檢測結果。藍色：IgG1 同型對照抗體的檢測結果
檢測結果：
結果表明，該內吞作用檢測試劑不僅適用于多種細胞類型的抗體內吞評估，還可通過流式細胞術實現快速且定量的分析（圖 2A-B）。
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內吞檢測試劑濃度優化
為明確內吞檢測試劑（IGG-PZF2001）的最佳工作濃度，我們在CD20陽性與HER2陽性細胞系中開展系統性評估：固定一抗濃度為 2µg/mL，同步設置檢測試劑濃度梯度（1µg/mL、2µg/mL、4µg/mL）。
劑量依賴性分析顯示：隨檢測試劑濃度從 1µg/mL 升至 4µg/mL，陽性信號顯著增強，但 4µg/mL 高濃度會導致對照組背景信號同步升高。綜合信噪比（SNR）分析表明，兩種細胞系中均以 “1µg/mL 檢測試劑 + 2µg/mL 一抗”（1:2 比例）實現檢測靈敏度與背景抑制的最佳平衡（圖 3 A-D）。
這一優化后的條件為后續的內吞作用檢測實驗建立了一套可靠且經濟高效的實驗方案。
圖3 不同檢測試劑濃度下抗體內吞作用的流式細胞術（ACS）分析。A：CD20 陽性細胞系中的檢測試劑對照組；B：CD20 陽性細胞系中檢測試劑與 CD20 特異性抗體利妥昔單抗（Rituximab）共孵育組；空白組（Blank）：僅含細胞；紅色（Red）：1 μg/mL檢測試劑；藍色（Blue）：2 μg/mL檢測試劑；紫色（Purple）：4 μg/mL檢測試劑；C：HER2 陽性細胞系中的檢測試劑對照組；D：HER2 陽性細胞系中檢測試劑與 HER2 特異性抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab）共孵育組；空白組（Blank）：僅含細胞；紅色（Red）：1 μg/mL檢測試劑；藍色（Blue）：2 μg/mL檢測試劑；綠色（Green）：4 μg/mL檢測試劑
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內吞檢測試劑孵育時間優化
為探究抗體內吞動力學規律，我們將抗體-試劑復合物分別與 CD20 陽性、HER2 陽性細胞系共孵育（30 分鐘至 4 小時），并通過流式細胞術分析熒光信號變化。結果顯示，內吞動力學呈現顯著細胞類型依賴性：
?? CD20 陽性細胞：整個孵育周期內，熒光強度隨時間呈持續增長；
?? HER2 陽性細胞：表現為雙相反應特征 —— 前2小時熒光信號變化極小，孵育至4小時時信號顯著增強（圖 4 A-D）。
這些不同的動力學模式證實了我們的內吞檢測試劑可通過定量熒光變化可靠地監測動態內吞過程，同時還能揭示內吞速率的靶標特異性差異。
圖4 不同孵育時間下抗體內吞的FACS分析。A：CD 20+細胞系中的檢測試劑對照。B：CD 20+細胞系中的檢測試劑和CD 20特異性抗體利妥昔單抗。C：HER2+細胞系中的檢測試劑對照。D：HER2+細胞系中的檢測試劑和HER2特異性抗體曲妥珠單抗。空白：僅細胞。紅色：30 min，藍色：1 h，紫色：2 h，綠色：4 h。
本研究結果強調了建立細胞系特異性檢測窗口的重要性，因為最佳檢測時間點可能會因靶抗原和細胞環境的不同而存在顯著差異。這種時間特征分析為未來應用中的實驗設計提供了關鍵指導，同時也強調：對于每一種新的抗體-細胞系統組合，都應通過實驗確定其內吞動力學，以確保準確評估內吞效率。
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