表達異常問題的分析處理
不表達問題排查及解決方案（不表達的原因）
1.方案設計問題
Ø 密碼子移位：翻譯起始mRNA與插入片段序列形成二級結構，外源基因序列內部有核糖體結合位點、SD序列或者其他干擾性原件。
Ø 稀有密碼子問題：可以使用相關軟件分析稀有密碼子問題，建議有條件的實驗室進行重組蛋白表達前密碼子分析優化；起始位點前15個氨基酸的密碼子對表達至關重要；連續2個稀有密碼子可能導致表達效率大大降低。
Ø 真核蛋白信號肽問題：大腸桿菌缺乏加工真核蛋白信號肽的機制。
Ø GC含量太高：一般GC含量超過70%都是難于表達，通過基因修改降低GC含量；
Ø 蛋白大小問題：一般小于10kD或者大于100kD蛋白都是難于表達。
Ø 標簽蛋白的選擇：
在盡可能不影響目標蛋白的結構的情況下，選擇合適的標簽，通過標簽蛋白的高產量強啟動表達帶動目標蛋白的表達。
2.操作過程問題
質粒構建，表達工程菌使用等失誤造成。
1）質粒構建完之后，除了普通的酶切鑒定和PCR鑒定外，必須測序確認，無任何突變，更不能多余或者確實堿基，確認外源片段插入后讀碼框與載體步調完全一致。
2）表達宿主菌首先必須確認標準有效，必須與載體質粒配套[比如，我們配合pET系列載體T7啟動子的表達菌是BL21(DE3),而不是BL21],同時必須清楚知道整個體系的操作【比如，Rosetta(DE3)菌使用時必須額外添加氯霉素，否則，其額外攜帶的助表達質粒容易丟失；比如，含CspA啟動子的載體，誘導劑不是IPTG，而是降低溫度，不是所有的表達誘導都是用IPTG來完成的】
3.蛋白容易降解問題：
宿主菌體內的很多的蛋白酶將重組蛋白降解了，特別是N-端是Arg、 Leu、Lys、Phe、Trp,或Tyr時，這就是N-末端規則；C-末端5個氨基酸是非極性氨基酸也容易被降解。這些蛋白即使表達了，如果快速降級了，也很難檢測到目的蛋白表達。
4、培養基問題：
很多在LB培養基中不表達的重組蛋白，更換了TB或2×YT培養基以后表達成功。
5、 重組蛋白有毒性或者影響宿主菌生理功能
對于這類蛋白應考慮更為嚴謹的表達載體系統。
6、 蛋白痕量或者表達帶與宿主菌自身蛋白某高濃度帶重疊
建議用標簽抗體的Western Blot進行確認。
7、 分子量異常問題
有些蛋白的分子量與預期有偏差，SDS-PAGE電泳是結合電荷/電場與聚丙烯酰胺凝膠孔徑分析蛋白質分子量，如果蛋白質本身氨基酸組成不符合均態分布規律，會造成在SDS-PAGE膠中遷移率異常，比如P53蛋白，實際分子量只有40多kD,其電泳顯示為53kD,后經過分析，其序列內部含有大量的Pro，更多的實例也表明內部富含pro的蛋白序列會造成蛋白在SDS-PAGE電泳中遷移率顯示偏大。實驗時需要仔細比對誘導/非誘導菌體蛋白帶譜差異，結合Western Blot和純化數據做出判斷，必要時可進行質譜確認。