SSH抑制性消減雜交文庫構(gòu)建方法介紹-技術(shù)前沿-資訊-生物在線

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SSH抑制性消減雜交文庫構(gòu)建方法介紹

作者:上海基星生物科技有限公司 2008-05-24T00:00 (訪問量:25993)

?SSH是一項可以快速獲取兩個不同生物材料中差異表達(dá)基因的分子生物學(xué)技術(shù),是快速篩選差異表達(dá)基因的有效方法,也是尋找新基因的重要手段。該技術(shù)尤其適合以genome尚不完全清晰的物種或者以特殊材料為研究對象的科研工作者。是基因芯片技術(shù)的有效補(bǔ)充。

? ?基本流程:通過差減文庫構(gòu)建,文庫驗證和篩選(逆向斑點雜交),獲得陽性克隆,對陽性克隆測序及生物信息分析,可判定差異基因的情況。另外結(jié)合RACE技術(shù)可進(jìn)一步克隆所獲得的差異基因的cDNA全長序列,并可用Northern blot RealTime PCR加以驗證。

? 抑制性消減雜交文庫技術(shù)

是一種革命性的差異表達(dá)基因篩選技術(shù)。該方法結(jié)合了抑制性PCR和消減雜交技術(shù),即御用PCR反應(yīng)鏈內(nèi)退火有限于鏈間退火的特點和分子雜交二級動力學(xué)原理,經(jīng)過體系不斷優(yōu)化建立起來的快捷、有效的差異基因篩選方法。與傳統(tǒng)的DDPCRSAGEcDNARNA等技術(shù)相比,具有低豐度mRNA富集效率高、假陽性低、靈敏度高重復(fù)性好等特點。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物發(fā)育和分化、疾病易感性差異、抗藥性差異和組織(病理和正常樣本)差異及微生物基因分型差異的研究。

技術(shù)方法成熟有效

不需要利用傳統(tǒng)的物理方法對單鏈、雙鏈cDNA進(jìn)行分離。只要目的序列存在,就能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,篩選出差異基因片段。

放大稀有轉(zhuǎn)錄本

本技術(shù)在同一操作完成轉(zhuǎn)錄本豐度平衡和差減,在我們的模型實驗中,稀有轉(zhuǎn)錄本至少被放大了5000倍,也就是說,利用本及時可以極大地增加獲得表達(dá)差異地稀有轉(zhuǎn)錄本地可能性。

僅僅需要500ngpoly A RNA

與其他的消減雜交方法不同,應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)只需要0.52poly A+ RNA即可進(jìn)行有效實驗。如果您只有極少量(50ng-100ng)的總RNA,我們可以通過poly A RNA的高保真線性放大技術(shù)來合成足量的cDNA來進(jìn)行抑制性消減雜交實驗。

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