新冠疫情快速蔓延，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成了巨大的威脅，接種安全、有效的新冠疫苗是當(dāng)下人們的迫切需求。截至2021年7月，全球共有19款新冠疫苗被批準(zhǔn)上市，種類包括滅活疫苗、mRNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白亞單位疫苗和減毒活疫苗。另外，有128款疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，其中有11款是DNA疫苗。
DNA疫苗具有易于設(shè)計(jì)和量產(chǎn)、生產(chǎn)成本低、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)比傳統(tǒng)類型的疫苗存在明顯優(yōu)勢(shì)。此外，根據(jù)新冠DNA疫苗臨床試驗(yàn)發(fā)表的數(shù)據(jù)，DNA疫苗能夠很好兼顧有效性與安全性，是未來疫苗研發(fā)新趨勢(shì)，因此對(duì)新型新冠DNA疫苗的研發(fā)仍在火熱進(jìn)行中。
2021年5月27日，Kit Man Chai等人在《PLOS Neglected Tropical Diseases》期刊發(fā)表了文章《DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsters》，研究者通過質(zhì)粒構(gòu)建得到6種不同的DNA候選疫苗，并對(duì)這些候選疫苗的有效性和安全性進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證，最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了接種DNA疫苗可有效防護(hù)新冠病毒感染。這項(xiàng)研究的詳細(xì)解讀如下：
候選DNA疫苗的質(zhì)粒構(gòu)建與抗原表達(dá)
圖1.候選DNA疫苗的質(zhì)粒構(gòu)建與抗原表達(dá)
實(shí)驗(yàn)流程如圖圖1.所示。研究者首先對(duì)SARS-CoV和SARS-CoV-2各構(gòu)建了一種表達(dá)全長S蛋白的質(zhì)粒。此外，由于抗原表達(dá)與疫苗效力密切相關(guān)，研究者又對(duì)SARS-CoV-2設(shè)計(jì)了4種不同的Spike基因片段，共得到6種不同的候選疫苗，它們分別為：
1. pSARS-S：表達(dá)SARS-CoV全長S蛋白的質(zhì)粒；
2. pSARS2-S：表達(dá)SARS-CoV-2全長S蛋白的質(zhì)粒；
3. ptSARS2-S：信號(hào)肽為組織纖溶酶原激活(tPA)前導(dǎo)序列的SARS-CoV-2全長S蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
4. ptRBD：信號(hào)肽為tPA前導(dǎo)序列的SARS-CoV-2 RBD表達(dá)質(zhì)粒，RBD表達(dá)片段為aa319-aa541；
5. ptRBDTM：信號(hào)肽為tPA前導(dǎo)序列的SARS-CoV-2 RBD至跨膜區(qū)表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)區(qū)間片段為aa319-aa1236；
6. ptSdTM：信號(hào)肽為tPA前導(dǎo)序列的SARS-CoV-2跨膜結(jié)構(gòu)域缺失的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)區(qū)間為aa13-aa1213。
圖2. Spike蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析
數(shù)據(jù)顯示（圖2）pSARS-S與pSARS2-S皆可在相應(yīng)的分子量處檢測到全長S蛋白。ptSARS2-S、ptRBDTM和ptSdTM變體的表達(dá)水平相似，ptRBD的表達(dá)水平最高。
候選疫苗的篩選
圖3. 候選DNA疫苗的驗(yàn)證方法
1. 評(píng)估候選疫苗的有效性與長效性
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pSARS-S和pSARS2-S免疫動(dòng)物的血清均可識(shí)別SARS-CoV-2的全長S區(qū)，S2區(qū)和RBD區(qū)，且IgG抗體滴度相近，但只有pSARS2-S可以引起高水平中和反應(yīng)（圖4.）
此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證pSARS2-S免疫效果，研究者還使用了中和抗體滴度檢測試劑盒對(duì)血清樣本中抗體對(duì)ACE2結(jié)合RBD的抑制能力進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明 pSARS2-S免疫可以誘導(dǎo)競爭性抗體，有效地阻斷新型冠狀病毒RBD與ACE2受體的結(jié)合。
圖4. 接種pSARS-S和pSARS2-S疫苗免疫小鼠后的抗體反應(yīng)
研究者還對(duì)比了不同候選DNA疫苗的免疫原性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)全長S蛋白的抗體滴度ptSARS2-S＞ptRBD＞ptSdTM＞ptRBDTM，對(duì)RBD的抗體滴度ptRBD＞ptSARS2-S＞ptSdTM＞ptRBDTM。這些不同的變體并沒有誘導(dǎo)比pSARS2-S更高的中和抗體水平（圖5）。
圖.5. 接種SARS-CoV-2不同變體疫苗免疫小鼠后的抗體反應(yīng)
另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小鼠免疫20周后血清中全長S蛋白的IgG滴度無明顯變化，中和抗體滴度降幅約18.6%，這意味著pSARS2-S免疫可對(duì)新冠狀病毒產(chǎn)生了持久的體液應(yīng)答。
2. 評(píng)估疫苗的安全性
根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，Th2細(xì)胞反應(yīng)相較于Th1的免疫反應(yīng)具有更高的疫苗相關(guān)性呼吸道疾病（VAERD）的風(fēng)險(xiǎn)，這意味著偏向Th1的免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的副作用風(fēng)險(xiǎn)可能較低。Th1細(xì)胞反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子(IFN-γ)，而Th2細(xì)胞反應(yīng)可產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-5和IL-13。研究者通過ELISA方法檢測pSARS2-S疫苗注射后小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-5和IL-13的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中檢測到的子IFN-γ的含量遠(yuǎn)高于IL-5和IL-13的含量，這意味著注射pSARS2-S DNA疫苗可產(chǎn)生偏向于Th1細(xì)胞反應(yīng)。
綜上所述，pSARS2-S疫苗是合適的候選疫苗，可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，并且具有保護(hù)效力時(shí)間長、安全性好等特點(diǎn)。
pSARS2-S疫苗對(duì)SARS-CoV-2的保護(hù)效果
圖6. DNA疫苗動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)流程
圖7. 活病毒攻擊三天后檢測倉鼠肺中的病毒RNA拷貝數(shù)和抗體滴度
總結(jié)
在對(duì)新冠疫苗火熱研發(fā)的同時(shí)，我們也要關(guān)注到新冠病毒不斷地在進(jìn)行新的突變及流行，對(duì)疫苗的有效性已經(jīng)構(gòu)成了逾加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此研究者也需要對(duì)突變株疫苗投入更多的研究。
在本研究候選疫苗有效性評(píng)估過程中，研究者采用ACROBiossystems提供的中和抗體滴度檢測試劑盒（Cat.No.TAS-K022）評(píng)估血清樣本中抗體對(duì)ACE2結(jié)合RBD的抑制能力,所得結(jié)果與CPE方法檢測中和抗體和對(duì)SARS-CoV- 2 RBD病毒的ELISA滴度結(jié)果一致。
檢測原理：
試劑盒應(yīng)用競爭ELISA方法。樣本中的中和抗體與微孔板上固定的Human ACE2 Protein競爭結(jié)合HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike，在450nm處測定樣本吸光度值（OD450nm），樣本OD450nm與樣本中中和抗體的含量呈負(fù)相關(guān)。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
> 操作簡單，方便可靠
> 可同時(shí)檢測90+樣本
應(yīng)用場景：
可用于新冠疫苗的研究，血清樣本中的中和抗體進(jìn)行檢測等。
產(chǎn)品列表
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驗(yàn)證數(shù)據(jù)
圖8. TAS-K022 與 FDA 批準(zhǔn)的 ELISA 試劑盒的相關(guān)性分析
經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使用上述ELISA試劑盒檢測接種疫苗的血清樣本對(duì)Wild type和B.1.1.7變異株的中和能力接近，但對(duì)B.1.351和P.1毒株的中和能力明顯下降（圖9）。
圖9. 新型冠狀病毒中和抗體滴度檢測試劑盒,包含WT-RBD（Cat. No. RAS-N022）、B.1.1.7 RBD（Cat. No. RAS-N028）、B.1.351 RBD（Cat. No. RAS-N031）、P.1 RBD（Cat. No. RAS-N034）、B.1.1.7 Spike（Cat. No. RAS-N036），B.1.351 Spike（Cat. No. RAS-N037）和P.1 Spike（Cat. No. RAS-N038），檢測56份接種疫苗后的血清樣本中的中和抗體，以研究疫苗對(duì)SARS-CoV-2相關(guān)變異株（VOC）的療效。
參考文獻(xiàn)：
1. https://covid19.trackvaccines.org/
2. https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html
3. DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsterss（May 27, 2021）https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009374
4. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines(June 15, 2020)https://doi.org/10.4049/jimmunol.1900517
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