抗體純化分為三級(jí)：
A:初級(jí)純化：(NH4)2SO4或辛酸
B:中級(jí)純化：廣譜Protein?A?，Protein?G
C:高級(jí)純化：抗原配體特異性純化
所需溶液：1mM?HCl，PBS
A.飽和硫酸銨配制：無菌去離子水加入足量硫酸銨之后，加熱到65℃以上，在磁力攪拌器上攪拌溶解到底部仍有未溶解的硫酸銨，待冷卻后，取上清濾紙過濾。
B.BaCl2：0.02M/L
C.偶聯(lián)緩沖液：0.5M?NaCl，0.1M?NaHCO3，pH8.3-8.5
D.封閉緩沖液：1）1M乙醇銨?????2）0.2M甘氨酸（pH8.0）
E.乙酸鹽緩沖液：含0.5M?NaCl的0.1M?醋酸，pH4
F.20%乙醇（PBS中）0.02%NaN3
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1.初級(jí)純化(NH4)2SO4
1）飽和硫酸根配制和NH4+
2）透析后硫酸根和NH4+檢測
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2.中級(jí)純化
抗血清的親和純化（Protein?A∕?Protein?G）
所需溶液：
A.0.1M??Gly-HCl（pH2.7）[洗脫液]
B.0.5M??Tris-Cl（pH8.0）[中和液]
C.PBS（pH?7.2）
D.?20%乙醇（20%乙醇in?PBS）0.02%NaN3[保存液]
1）血清預(yù)處理：?0.22孔徑濾器過濾血清，與等體積PBS混合，調(diào)至pH7.8，此時(shí)親和掛柱效果較好。
2）平衡親和柱，用10倍體積的PBS清洗柱子，同時(shí)將柱子下端與核酸蛋白檢測儀進(jìn)液口連接，并固定。
3）上樣：PBS平衡柱體時(shí)，調(diào)節(jié)核酸蛋白檢測儀數(shù)值穩(wěn)定在0左右，將樣品加入上樣柱床，核酸蛋白檢測儀上數(shù)值慢慢升高，收集液體（此液體簡稱流穿液，流穿液中可能還會(huì)有未被柱子抓取的抗體，所以暫時(shí)收集以再次過柱純化使用），當(dāng)核酸蛋白檢測儀的數(shù)值下降到平衡數(shù)值，不再下降時(shí)，停止收集流穿液。
4）抗體洗脫：當(dāng)核酸蛋白檢測儀的數(shù)值保持較低數(shù)值并穩(wěn)定時(shí)，待柱床液面快流干時(shí)，輕輕在柱床上加入洗脫液（盡量不要沖起柱床）；當(dāng)核酸蛋白檢測儀上數(shù)值迅速升高時(shí)，迅速承接洗脫的液體，并迅速用中和液中和，承接時(shí)宜多管順次接取，并記錄順序。
5）洗脫完畢后，當(dāng)數(shù)值變低并不再變動(dòng)，柱子用至少5倍體積的PBS?2-4?ml/min流速清洗平衡。
6）用保存液（20%的乙醇）封閉柱子上下兩端，4?℃保存。
3.高級(jí)純化（自制配體抗原親和柱）
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3.配體的抗原特異性親和純化
1.親和柱的制備
1）稱取0.3?g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠（1:3溶漲GE產(chǎn)品貨號(hào)27-0430-1）加入1mmol/L鹽酸中，常溫?cái)嚢柚辽?0分鐘（或者4℃過夜使其充分溶漲），可以獲得1ml溶漲膠。
2）將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約30ml?1mmol/L的鹽酸抽濾介質(zhì)3次，[抽濾去除內(nèi)部空氣氣泡]。
3）用5-10倍體積的超純水清洗介質(zhì)一遍，（留1-2倍體積超純水將凝膠重懸起來）。
4）將待偶聯(lián)配體用偶聯(lián)緩沖液溶解成2mg/ml濃度
5）將重懸的凝膠與偶聯(lián)配體液迅速混合，室溫（25℃）反應(yīng)2小時(shí)以上，期間不斷搖動(dòng)，使其充分偶聯(lián)反應(yīng)。
6）偶聯(lián)結(jié)束，取上清液檢測是否還有游離未偶聯(lián)的配體（蛋白或抗體），檢測方法：用分光光度計(jì)直接檢測計(jì)算，如果溶液中配體行亮＞0.2mg/mL，說明偶聯(lián)飽和；否則需加入配體重復(fù)第4）第5）步。（一般1ml凝膠可以偶聯(lián)10mg蛋白配體）
7）封閉：確認(rèn)偶聯(lián)完全后，取?15ml封閉緩沖液（1M?乙醇胺或者0.2M?甘氨酸pH8.0）室溫(25℃)孵育2小時(shí)或4?℃過夜。
8）交替使用20ml的偶聯(lián)緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗凝膠柱4次。
9）親和柱制備好后，用PBS平衡后即可用于抗體純化。
10）如若暫不使用，用20%的乙醇保存（或含0.02%?NaN3的PBS）。
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2.用自制配體抗原親和柱純化（其純化方法與中級(jí)純化方法相同）
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3.抗體純化的后處理
抗體純化完后，要將其緩沖液置換成PBS，便于后期標(biāo)記成其他用途使用，如果濃度太低，需要濃縮。
透析濃縮方法：
A.透析袋濃縮—不要用蔗糖濃縮
將純化的抗體裝入透析袋中，透析袋表面覆滿PEG20000進(jìn)行濃縮
B.超濾管濃縮
將純化的抗體轉(zhuǎn)入15?ml的超濾管，3500g離心12分鐘左右（根據(jù)要濃縮的體積摸索離心時(shí)間）。
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抗體濃度測定：
取適量抗體檢測OD280nm的吸光度，讀數(shù)不要超過2。如果讀數(shù)超過2，再稀釋，用吸光度讀數(shù)除以1.35，再乘以稀釋倍數(shù)即為抗體的大致濃度。抗體的濃度也可以用（OD280nm-0.35×OD495nm）/1.4這個(gè)公式計(jì)算。濃縮抗體濃度最好不要太高，太高容易引起沉淀。