通過間接ELISA法來確定抗原最佳包被濃度 (方陣滴定，也叫棋盤滴定法) 。下面以兔高免血清多抗效價檢測為例
1. 抗原用包被緩沖液CBS (0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)按1μg/ml濃度用作連續(xù)1:2倍比稀釋，每個稀釋度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶標(biāo)板中，覆膜密封（防止水分揮發(fā)）4℃包被過夜(12h以上)。
2. 次日甩掉板中液體，在吸水紙上拍干板子，每孔加入150μl封閉液(含2% BSA的包被緩沖液CBS），室溫（25℃） 2h以上。
3. 用洗滌液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此時將待測高免陽性血清和空白陰性血清用抗體稀釋液（含1% BSA的PBS緩沖液,pH7.4）分別從1:500開始做連續(xù)1:2倍比稀釋，按下圖分布模式100μl/孔，37℃ 1h。
4. 取出拍干，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗體稀釋液1:3000稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，F(xiàn)rdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。
5. 取出拍干，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl單組份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室溫孵育5～20min（根據(jù)顏色的改變速度）。
6. 每孔加入50μl終止液（0.5M H2SO4）。
7. 在酶標(biāo)儀上讀取450nm/630nm的吸光度。
標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果分布模式應(yīng)該如上圖所示： ELISA酶標(biāo)板顯色由陰陽性區(qū)域第一行第一列孔向外顯均勻放射狀遞減；如果在包被梯度方向上OD450過高無梯度，應(yīng)該繼續(xù)降低包被濃度；反之，則增加。同理，如果在免疫血清稀釋度方向上OD450過高無梯度，則應(yīng)繼續(xù)加大稀釋度，反之，則減小。
8. 最佳包被濃度的確定:
陽性血清區(qū)域內(nèi)某個孔對應(yīng)的OD值與其上/其左孔OD值恰好為2倍關(guān)系且OD值不低于1.2,且此孔對應(yīng)的陰性血清區(qū)域OD值與空白對照孔OD值無差異，此孔包被的抗原濃度的2倍確定為抗原的最佳包被濃度。同理也可以參照此方法確定陽性血清的最佳稀釋倍數(shù)。
如果方陣滴定的數(shù)值結(jié)果不能如圖分布，則需要重新設(shè)計方陣實驗。
9. 以最佳包被濃度將抗原按照上述方法包被到酶標(biāo)板同時封閉，將陰性/陽性血清依次倍比稀釋，100μl加到酶標(biāo)板孔（最好做復(fù)孔），然后依次加入二抗、底物顯色，讀取OD值。
對應(yīng)稀釋度陰性血清OD值的2.1倍確定為陽性值，也稱Cut-off值，這個是檢驗學(xué)上的常用方法，而往往制備抗體的高免血清的稀釋度都比較高，其對應(yīng)稀釋度的陰性血清值接近于空白值，所以這個判斷方法作為ELISA稀釋終點沒有意義，F(xiàn)rdbio定義ELISA終點方法為：OD值-空白值或陰性對照值≧0.100（前提條件是空白孔值/陰性對照孔OD值﹤0.050），可以根據(jù)自己的實驗室具體情況自己確定合適的終點判定標(biāo)準(zhǔn)。
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
包裝/規(guī)格 |
產(chǎn)品描述 |
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ELS0001 |
高吸附酶標(biāo)板 |
10plates |
蛋白吸附量大，背景低。 |
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ELS0203 |
酶標(biāo)板穩(wěn)定劑 |
10plates |
穩(wěn)定抗原包被后的酶標(biāo)板，穩(wěn)定期長達(dá)2年，檢測值下降不超過15%。 |
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ELS0030 |
Efficent Coating Plate |
10 plates |
供價包被不易脫落，包被環(huán)境中性，不損傷蛋白，蛋白用量少。 |
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IMR0201 |
抗體稀釋液 |
100ml |
最大提高抗原抗體結(jié)合，同時降低非特異性結(jié)合背景問題。 |
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IMR0202 |
HRP酶標(biāo)抗體稀釋液 |
100ml |
最大提高抗原抗體結(jié)合，提高酶活性，降低非特異性酶底反應(yīng)。 |
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ELS0010 |
FrdbioR單組份TMB |
100ml/500ml |
即用型TMB底物，直接使用，靈敏度穩(wěn)定性優(yōu)于進(jìn)口Sigma T0440 |
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IMR0101 |
Frdbio免疫檢測信號增強(qiáng)劑 |
100ml/500ml |
增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合,最高可以提高信號10倍,適用于ELISA和Western Blot。 |