來源：華中農(nóng)大
目前，如何在細(xì)胞內(nèi)高效且特異地引入單核苷酸突變成為基因編輯的重大研究方向。CRISPR/nCas9/dCas9技術(shù)融合胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯系統(tǒng)自研發(fā)以來被廣泛關(guān)注，該系統(tǒng)不需要產(chǎn)生DSB和提供DNA模板就能有效地替代基因組中的特定堿基。堿基編輯器包含Cas9 蛋白變體、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）（圖1 單堿基編輯示意圖）。
CRISPR/Cas9作為一種新型的基因編輯技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于多種物種的基因組編輯研究。由于低效率的同源重組修復(fù)及無法預(yù)期的編輯類型，CRISPR/Cas9技術(shù)多用于基因敲除的研究。
圖1 單堿基編輯系統(tǒng)工作示意圖
2019 年 5 月 22 日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團隊題為 "High Efficient and Precise Base Editing of C?G to T?A in the Allotetraploid Cotton (Gossypium hirsutum) Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System " 的研究論文，該論文利用Cas9 缺口酶(nCas9)，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。實現(xiàn)了在棉花細(xì)胞內(nèi)高效且特異地引入單核苷酸突變，具有很高的C?G to T?A 的單堿基編輯效率，并且可以進行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。
在此之前，華中農(nóng)大棉花團隊已經(jīng)發(fā)表了3篇關(guān)于棉花基因編輯的研究論文，系統(tǒng)的對棉花中不同方式的基因編輯進行了研究：2017 年建立了國際上最早的棉花編輯系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)使用了棉花內(nèi)源的U6啟動子和合適的抗生素篩選標(biāo)記，使得CRISPR/Cas9技術(shù)在異源四倍體棉花中的應(yīng)用具有高效特異的編輯；2018 年利用高通量測序的方法，揭示了在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少，更多地是受體材料固有遺傳或/和體細(xì)胞無性系變異；2019年分析了 Cpf1 ( Cas12a ) 蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
在本研究中，作者利用Cas9 缺口酶(nCas9)，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。選擇兩個內(nèi)源基因（GhCLA, GhPEBP），設(shè)計了三個靶標(biāo)（sgRNA1, sgRNA2靶向GhCLA基因, sgRNA3靶向GhPEBP基因），構(gòu)建單堿基編輯載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行棉花遺傳轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)在棉花中靶標(biāo)基因 GhCLA, GhPEBP的三個靶標(biāo)均被編輯，而且C-T的編輯效率達(dá)到57.78%，以靶標(biāo)位點上多個C位點同時編輯為主；該系統(tǒng)在靶標(biāo)序列上的“編輯窗口”為6個堿基（PAM序列遠(yuǎn)端5 '端3 - 8的位置），且 “編輯窗口”內(nèi)C-T替換效率在總DNA序列中達(dá)到18.63％，靶標(biāo)序列編輯窗口內(nèi)的C-T編輯效率遠(yuǎn)高于其余部位C-T替換的效率（圖2）。
圖2 GhCLA和GhPEBP基因靶標(biāo)位點編輯檢測及窗口內(nèi)位點的突變檢測
研究人員利用深測序檢測27個潛在脫靶位點，在潛在脫靶位點的編輯窗口內(nèi)發(fā)生C-T替換比例均低于0.1%，統(tǒng)計分析后堿基編輯的植株和野生植株沒有脫靶效率的差異。此外，將兩個GhCLA 基因編輯的單株和一個野生（Jin668）植株進行100×深度的全基因組測序以檢測脫靶效應(yīng)。在從全基因組水平預(yù)測的1500個潛在脫靶位點上沒有發(fā)現(xiàn)脫靶突變，這表明單堿基編輯系統(tǒng)對棉花的基因組編輯具有較強的特異性（圖3）。
圖3 GhBE3系統(tǒng)在棉花中的全基因組測序
該CRIPSR單堿基編輯系統(tǒng)在異源四倍體棉花中首次應(yīng)用，具有較高的C?G to T?A 的單堿基編輯效率和特異性，它將成為棉花功能基因組研究新的重要的技術(shù)手段。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室金雙俠教授為該論文的通訊作者，已畢業(yè)的碩士秦雷為第一作者，張獻(xiàn)龍教授也參與了這項工作。該研究受到國家重點研發(fā)計劃 ( 2016YFD0100203-9 ) 和科技部轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項 ( 2016ZX08010001-006 ) 和中央高校科研經(jīng)費 ( 2013PY064,2662015PY028,2662015PY091 和 0900206328 ) 的支持。
論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13168
北京安必奇生物科技有限公司始終走在科學(xué)前沿，我們提供CRISPR單堿基編輯和CRIPSR/Cas9基因編輯服務(wù)，致力于更好地服務(wù)植物遺傳轉(zhuǎn)化研究。