DIFF-rGFP系統(tǒng)：肉眼觀測(cè)，可高通量
貓傳染性腹膜炎（FIP）由貓冠狀病毒（FCoV）引起，是一種高致死性疾病，主要表現(xiàn)為滲出型（濕性）和非滲出型（干性）。其中，干性FIP以多器官肉芽腫性病變?yōu)樘卣鳎改c道受累罕見(jiàn)，診治困難。該病曾長(zhǎng)期缺乏有效療法，死亡率極高。核苷類似物GS-441524是一種對(duì)貓傳染性腹膜炎（FIP）效果顯著的抗病毒藥物，它通過(guò)抑制病毒RNA聚合酶來(lái)阻斷病毒復(fù)制，為FIP治療帶來(lái)了新希望。
2025年8月，韓國(guó)大邱的慶北國(guó)立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)內(nèi)科系及獸醫(yī)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所發(fā)表了一篇關(guān)于探討一例FIP病毒感染引發(fā)橫結(jié)腸肉芽腫性病變，并接受GS-441524治療的臨床過(guò)程與療效的文獻(xiàn)：
一只7歲去勢(shì)雄性家養(yǎng)短毛貓因食欲減退及間歇性嘔吐就診，嘔吐表現(xiàn)為每周一次、單次嘔吐量少但發(fā)作頻繁。體格檢查見(jiàn)輕度脫水，未見(jiàn)其他顯著異常。
實(shí)驗(yàn)室檢查顯示：白球比降低（0.5），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶輕度升高（78 U/L，參考范圍0–48 U/L），輕度白細(xì)胞增多（19.84×10?/L，參考范圍2.87–17.02×10?/L），貓血清淀粉樣蛋白A顯著升高（19.9 µg/mL，參考范圍＜5.0 µg/mL）。貓白血病病毒抗原及貓免疫缺陷病毒抗體檢測(cè)（使用IDEXX Snap Combo試劑盒）結(jié)果為陰性。
影像學(xué)方面：腹部超聲見(jiàn)橫結(jié)腸區(qū)域腸壁層次結(jié)構(gòu)消失、腸壁增厚（圖1A、B），測(cè)量厚度分別為8.4 mm與5.9 mm，腸腔未見(jiàn)明確梗阻。鄰近腸系膜淋巴結(jié)增大至11.9 × 38.6 mm，呈腫塊樣改變，周圍腹膜脂肪回聲增強(qiáng)（圖1C）。腹部CT進(jìn)一步證實(shí)橫結(jié)腸壁異常增厚伴密度增高（圖1D），于中腹部橫斷面可見(jiàn)三個(gè)連續(xù)、源自腸系膜淋巴結(jié)的非典型腫塊，鄰近橫結(jié)腸壁。增強(qiáng)掃描門(mén)脈期顯示腫塊內(nèi)部血管較豐富，強(qiáng)化不均勻，可見(jiàn)低密度區(qū)（圖1E）。周圍腹膜脂肪間隙出現(xiàn)條索影，提示局部脂肪組織及周圍結(jié)構(gòu)存在炎癥或異常改變。
圖1—患貓的腹部超聲檢查。（A, B） 部分橫結(jié)腸腸壁層次結(jié)構(gòu)消失并增厚。（C） 結(jié)腸壁病變周圍腹膜脂肪回聲增強(qiáng)，并伴有鄰近腸系膜淋巴結(jié)腫大。患貓的計(jì)算機(jī)斷層掃描。（D） 橫結(jié)腸壁異常增厚且放射性密度增高（黃箭頭所示）。（E） 在腹部中部橫斷面水平，觀察到三個(gè)連續(xù)的、源自腸系膜淋巴結(jié)的非典型腫塊。內(nèi)部實(shí)質(zhì)呈現(xiàn)不均勻強(qiáng)化，并伴有低密度區(qū)域（黃箭頭所示）。
超聲引導(dǎo)下病變部位細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查顯示細(xì)胞量稀少，未見(jiàn)明確惡性細(xì)胞證據(jù)（圖2A）。腸系膜淋巴結(jié)涂片可見(jiàn)上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及成簇脂肪細(xì)胞混合分布，背景中脂質(zhì)空泡增多，提示為非特異性非感染性炎癥病變伴局部脂肪壞死（圖2B）。
組織病理學(xué)檢查顯示，受累結(jié)腸及淋巴組織均可見(jiàn)重度化膿性肉芽腫性炎癥，主要以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主（圖2C-E）。炎癥累及全層結(jié)腸壁，導(dǎo)致腸壁顯著增厚（圖2C）。H&E染色未發(fā)現(xiàn)明確病原體，PAS染色未見(jiàn)真菌結(jié)構(gòu)（圖2F），F(xiàn)ite染色未檢出分枝桿菌（圖2G）。免疫組化染色顯示結(jié)腸壁炎癥區(qū)域FIP病毒抗原呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖2H、I）。
圖2—所獲結(jié)腸病變細(xì)胞學(xué)檢查[Diff-Quik染色，100×（A）]與鄰近腫大腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞學(xué)檢查[Diff-Quik染色，400×（B）]。（A、B） 細(xì)胞密度相對(duì)較低，未見(jiàn)明確惡性腫瘤證據(jù)。提示為非特異性、非感染性炎癥病變伴部分脂肪壞死。所獲結(jié)腸病變組織病理學(xué)檢查[H&E染色，100×（C）、400×（D）；PAS染色，200×（F）；Fite染色，200×（G）；免疫組化染色，50×（H）、200×（I）]及鄰近腫大腸系膜淋巴結(jié)檢查[H&E染色，400×（E）]。（D、E） 可見(jiàn)嚴(yán)重化膿性肉芽腫性炎癥，主要成分為巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。該炎癥貫穿增厚結(jié)腸壁全層（C），導(dǎo)致腸壁顯著增厚。（F、G） 增厚結(jié)腸壁炎癥區(qū)域內(nèi)未見(jiàn)真菌病原體及分枝桿菌屬。（H、I） 增厚結(jié)腸壁炎癥區(qū)域貓傳染性腹膜炎病毒免疫組化染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。
綜合上述結(jié)果，確診該橫結(jié)腸局限性病變及相關(guān)淋巴結(jié)病變由FIP病毒感染引起。
患貓接受GS-441524治療（6 mg/kg，q24h，SC）共12周。治療開(kāi)始3天后胃腸道癥狀改善，輔助用藥于7天后停用。
活檢時(shí)患貓?bào)w重約4kg，GS-441524治療前下降至3.5kg。治療后體重持續(xù)回升，12周療程結(jié)束時(shí)達(dá)4.6kg，隨訪期間進(jìn)一步增長(zhǎng)至5.72kg，嘔吐癥狀消失。白球比由活檢及治療初期的0.5逐步上升，治療結(jié)束時(shí)為0.7，后續(xù)提升至1.0。貓血清淀粉樣蛋白A（fSAA）從初始19.9 µg/ml升至治療初期25.5 µg/ml，后在療程結(jié)束時(shí)恢復(fù)正常（<5.0 µg/ml）并維持至末次隨訪。
影像學(xué)復(fù)查顯示，治療結(jié)束時(shí)橫結(jié)腸局部病灶及周圍淋巴結(jié)病變完全消退（圖3A），治療后第86周與第308周隨訪見(jiàn)結(jié)腸壁結(jié)構(gòu)保持正常（圖3B、C）。FCoV抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)陰，全血及糞便FCoV抗原RT-PCR結(jié)果均為陰性。血清白球比與fSAA持續(xù)處于正常范圍。截至診斷后44個(gè)月，患貓經(jīng)定期隨訪確認(rèn)仍存活。
圖3—患貓的腹部超聲檢查圖像。
（A) 在12周治療期結(jié)束時(shí)，橫結(jié)腸局部病灶及周圍淋巴結(jié)病變均已消退。（B) 治療后第86周隨訪時(shí)，以及（C) 治療后第308周隨訪時(shí)，結(jié)腸壁均保持正常結(jié)構(gòu)。
本病例證實(shí)，GS-441524對(duì)罕見(jiàn)非典型FIP（表現(xiàn)為局限性橫結(jié)腸肉芽腫病變）具有顯著療效。該病例診斷復(fù)雜，極易與腫瘤等疾病混淆，凸顯了影像學(xué)與組織病理學(xué)在鑒別中的重要性。治療后患貓癥狀完全消退，關(guān)鍵指標(biāo)恢復(fù)正常且長(zhǎng)期無(wú)復(fù)發(fā)，證明了該藥物能有效清除病毒并控制炎癥。這為GS-441524治療非典型FIP提供了有力依據(jù)，但其長(zhǎng)期安全性仍需進(jìn)一步研究。上述成功案例源于有效的藥物，而新藥的研發(fā)與優(yōu)化，則需要強(qiáng)大的體外篩選工具作為“引擎”。為此，「DIFF CRO」搭建了專業(yè)的貓傳腹體外藥效評(píng)價(jià)體系。
「DIFF CRO」貓傳腹體外藥效評(píng)價(jià)
「DIFF CRO」服務(wù)平臺(tái)可針對(duì)FIPV疫苗及藥物進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)。在候選藥物的細(xì)胞水平篩選階段，可進(jìn)行真病毒小分子藥篩，另外針對(duì)貓傳腹的蛋白酶靶點(diǎn)，「DIFF CRO」獨(dú)家開(kāi)發(fā)了蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)以幫助研發(fā)企業(yè)加速進(jìn)程，為早日實(shí)現(xiàn)合規(guī)獸藥、疫苗上市爭(zhēng)取更多時(shí)間。
FIPV真病毒小分子藥篩
針對(duì)FIP小分子治療藥物，「DIFF CRO」搭建了基于真病毒體系的體外藥效篩選平臺(tái)，用于系統(tǒng)評(píng)估候選化合物對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程的抑制能力。該平臺(tái)采用標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)體系和經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的FIPV真病毒株（見(jiàn)表1），在嚴(yán)格的生物安全條件下開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，能夠更真實(shí)地反映候選藥物在細(xì)胞環(huán)境中的抗病毒活性（圖4），為早期藥效判斷和化合物優(yōu)選提供可靠依據(jù)。
表1. 使用的FIPV毒株型別
圖4. GS-441524對(duì)FIPV WSU79-1146毒株的抑制率曲線
基于DIFF-rGFP系統(tǒng)的FIPV蛋白酶抑制劑篩選
FIPV病毒的多聚蛋白的裂解由兩種蛋白酶調(diào)控：主要蛋白酶（3CLpro，也稱為Mpro或nsp5）和木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）。3CLpro在病毒生命周期中發(fā)揮的重要作用，使其成為藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)有吸引力的重要靶點(diǎn)。而由「DIFF CRO」獨(dú)家開(kāi)發(fā)的蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)（DIFF-rGFP ），可在細(xì)胞水平直接模擬病毒自然感染過(guò)程，杜絕漏篩和假陽(yáng)性等情況，在新藥早期發(fā)現(xiàn)階段快速篩選大量化合物，其擁有諸多優(yōu)勢(shì)：
1）最簡(jiǎn)便：肉眼觀測(cè)
DIFF-rGFP可通過(guò)肉眼直接觀察藥物反應(yīng)的熒光變化（圖5），進(jìn)行定性判斷。
圖5. 使用DIFF-rGFP進(jìn)行FIPV陽(yáng)性藥物GC376篩選的熒光變化圖
2）最準(zhǔn)確：原理可靠
DIFF-rGFP 是基于特制質(zhì)粒的共表達(dá)機(jī)制，以FIPV為例，結(jié)合重組綠色熒光蛋白（rGFP）和FIPV的3CL蛋白酶。在該系統(tǒng)中，rGFP序列中嵌入了3CL蛋白酶的特異性切割位點(diǎn)。當(dāng)3CL蛋白酶功能正常時(shí)，會(huì)特異性裂解rGFP，導(dǎo)致其熒光功能喪失，熒光強(qiáng)度減弱。相反，當(dāng)抑制劑有效抑制了3CL蛋白酶的活性時(shí)，rGFP無(wú)法被切割，維持其完整性并正常發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖6）。藥物有效性與熒光強(qiáng)度成正相關(guān)，是一種更直觀的正向篩選方式。
圖6.DIFF-rGFP工作原理圖
3）快速高效的高通量篩選
系統(tǒng)檢測(cè)的熒光值低而信噪比好，可聯(lián)合現(xiàn)有藥物庫(kù)，一周即可篩選1萬(wàn)-10萬(wàn)個(gè)抗FIPV藥物候選化合物，快速鎖定有效藥物（圖7）。
圖7. 高通量篩選操作示意圖
4）穩(wěn)定且可重復(fù)
DIFF-rGFP 檢測(cè)呈現(xiàn)出更漸進(jìn)的反應(yīng)，因?yàn)樗鼫y(cè)量的是熒光強(qiáng)度，而不是直接測(cè)量病毒復(fù)制情況（圖8）。這種更平穩(wěn)的反應(yīng)可能會(huì)縮小檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍，但能提供更穩(wěn)定且可重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果。
圖8.DIFF-rGFP檢測(cè)的半數(shù)有效濃度（EC50）
「DIF CRO」憑借其獨(dú)有的DIFF-rGFP蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)，為FIPV藥物研發(fā)提供了簡(jiǎn)便直觀、準(zhǔn)確可靠、高效快速且穩(wěn)定可重復(fù)的體外藥效評(píng)價(jià)方案。該平臺(tái)將復(fù)雜篩選過(guò)程轉(zhuǎn)化為直觀的熒光信號(hào)，結(jié)合真病毒藥篩，構(gòu)成多方法評(píng)估體系，能極大加速候選化合物的早期發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化進(jìn)程，是助力新一代貓傳腹療法從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的關(guān)鍵加速器。
參考文獻(xiàn)：Kim TY, Oh YI. GS-441524 Treatment in a Cat With Feline Infectious Peritonitis Virus and Pyogranulomatous Transverse Colon Lesion. In Vivo. 2025 Sep-Oct;39(5):2760-2765.