CUT&RUN的8個基本步驟
CUT&RUN只包含幾個基本步驟！
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第一步 |
分離細(xì)胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上 |
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第二步 |
透化細(xì)胞 |
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第三步 |
加靶標(biāo)特異性抗體孵育 |
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第四步 |
pAG-MNase結(jié)合 |
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第五步 |
pAG-MNase激活 |
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第六步 |
DNA純化 |
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第七步 |
CUT&RUN文庫構(gòu)建 |
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第八步 |
Illumina®下一代測序 |
具體信息請見下方~
步驟1：分離細(xì)胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上
將細(xì)胞（或細(xì)胞核）與ConA包被的磁珠結(jié)合，ConA是一種與細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的凝集素。該步驟不僅支持高通量方法，而且簡化了后續(xù)從染色質(zhì)片段里分離細(xì)胞的操作。
避免磁珠干燥或結(jié)塊在本步驟中非常重要，因為這會導(dǎo)致樣品損失并降低產(chǎn)量。關(guān)于確認(rèn)細(xì)胞完整性及與ConA磁珠結(jié)合情況的重要質(zhì)量控制檢查信息，可以點擊此處獲取。除此之外，高質(zhì)量的樣本準(zhǔn)備對CUT&RUN的成功也至關(guān)重要，某些類型的樣本可能需要進行一定處理后方可使用，詳情可點擊Sample Prep查詢。
步驟2：透化細(xì)胞
由于洋地黃皂苷是一種非離子生物洗滌劑，可在低濃度下透化細(xì)胞膜。因此，在本步驟中使用含有洋地黃皂苷的緩沖液對固定好的細(xì)胞進行透化處理。透化處理對于抗體與pAG-MNase的結(jié)合至關(guān)重要，并且為后續(xù)MNase消化獲得的DNA能夠擴散到溶液中提供先決條件。洋地黃皂苷的用量必須根據(jù)所用細(xì)胞的類型進行優(yōu)化，以免在實驗中細(xì)胞出現(xiàn)裂解或不完全透化的情況，關(guān)于優(yōu)化處理的詳細(xì)信息，請點擊此處了解。
步驟3：加靶標(biāo)特異性抗體孵育
將目標(biāo)靶標(biāo)的抗體添加到反應(yīng)中，并在4℃下孵育過夜。我們建議每個實驗中設(shè)置陰性對照（如IgG）和陽性對照（如H3K4me3）反應(yīng)。
抗體的特異性和結(jié)合效率對于CUT&RUN的成功至關(guān)重要。事實上，這種檢測的背景非常低，以至于低效率的抗體無法達到足夠高的產(chǎn)量進行PCR和測序。相反，非特異性抗體可能會提供相當(dāng)好的產(chǎn)量，但會導(dǎo)致錯誤的生物學(xué)解釋。詳情參考抗體選擇和檢測控制的附加說明。
步驟4：pAG-MNase結(jié)合
第二天，洗滌與磁珠結(jié)合的細(xì)胞，除去未結(jié)合及非特異性結(jié)合的抗體。在沒有鈣離子（Ca2+）存在的條件下，將pAG-MNase添加到反應(yīng)體系中，以防止MNase的過早激活。pAG的免疫球蛋白結(jié)合特性會將MNase“栓”在抗體結(jié)合的染色質(zhì)上。pAG-MNase孵育后，多次洗滌細(xì)胞/磁珠混合物，以去除過量的pAG-MNase，防止非特異性切割。
步驟5：pAG-MNase激活
向反應(yīng)中加入Ca2+以激活MNase，MNase會在抗體結(jié)合處的兩側(cè)切割DNA。被切割下來的片段擴散至上清液中，而剩余的大塊染色質(zhì)保留在磁珠固定的細(xì)胞內(nèi)。
由于MNase是一種加工酶，所以必須終止反應(yīng)，以防止釋放的DNA片段被過度消化掉。pAG-MNase孵育后，加入含有EDTA和EGTA的Stop緩沖液以螯合游離鈣離子并終止酶活性。短暫加熱反應(yīng)體系以降解RNA，并將剩余的染色質(zhì)片段釋放至溶液中。
步驟6：DNA純化
因為細(xì)胞仍與磁性ConA珠結(jié)合在一起，所以CUT&RUN富集DNA的分離很簡單。利用磁性，將含有大量染色質(zhì)的磁珠偶聯(lián)細(xì)胞與剪切下的目標(biāo)DNA片段分離開，目標(biāo)DNA被留在溶液中。目標(biāo)DNA片段純化后，通過熒光測定（例如ThermoFisher QubitTM）進行定量。
DNA產(chǎn)量一般不作為表明CUT&RUN成功的指標(biāo)，相反，當(dāng)目標(biāo)是~5 ng DNA時，后續(xù)CUT&RUN文庫制備的效率較高。由于原始的CUT&RUN DNA產(chǎn)量通常低于Bioanalyzer / TapeStation的檢測極限，所以不建議使用這些方法在Bioanalyzer / TapeStation上分析原始的CUT&RUN DNA。
EpiCypher還檢測了陽性對照和實驗靶標(biāo)高于IgG陰性對照反應(yīng)的產(chǎn)量（即使只是略高）。根據(jù)概述的指標(biāo)確認(rèn)好DNA質(zhì)量后，即可進行下一步的文庫構(gòu)建。
步驟7：CUT&RUN文庫構(gòu)建
將修復(fù)純化的CUT&RUN DNA連接到測序adapter上，并進行PCR擴增以生成測序文庫。PCR擴增使用了針對CUT&RUN低產(chǎn)量和小片段規(guī)格的優(yōu)化參數(shù)，條形碼引物用于實現(xiàn)多路測序。EpiCypher的Library Prep Kit經(jīng)過專門優(yōu)化，可以進一步簡化您的工作流程。
在測序之前，確認(rèn)CUT&RUN成功的最佳方法是對純化文庫進行片段大小分布的分析。使用毛細(xì)管電泳（例如Agilent Bioanalyzer或TapeStation）確認(rèn)CUT&RUN文庫的片段大小分布和濃度。由于MNase將片段消化到核小體水平的分辨率，所以平均峰值一般約為~300 bp（~170 bp的片段DNA+adapter）。有關(guān)確保測序文庫質(zhì)量的更多詳細(xì)信息，請參閱該文。
步驟8：Illumina®下一代測序
文庫以等摩爾比例匯集，并加載到所需的平臺上進行測序。每個樣本只需要300-800萬次讀取，就可以獲得背景上的穩(wěn)健信號（相比之下，ChIP-seq則需要超過2000萬次讀取），并且允許用戶在單次運行中多路傳輸10-100個樣本。
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EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold™開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)導(dǎo)者。利用其獨有技術(shù)，不斷添加高純度修飾重組核小體（dNucs™）產(chǎn)品。dNuc™多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強大的工具。
EpiCypher還將dNuc™技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)），dCyher™測定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析。
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