NAR新突破：CliPEdit調控RNA功能與m?A甲基化，翌圣試劑助力

RNA 表觀修飾與動態功能調控，正成為解碼生命機制、突破疾病研究的核心賽道。N?- 甲基腺嘌呤（m?A） 作為真核生物 mRNA 最普遍的可逆修飾，其位點特異性、時空精準調控是解析 RNA 生命周期、基因表達與細胞命運的關鍵。然而傳統調控技術多為單向開關（ON或OFF），難以實現多步、可逆、按需調控，極大地限制了m?A 動態機制的深入探索。

近日，武漢大學周翔、田沺教授團隊在國際頂級期刊《Nucleic Acids Research》（IF=13.1）上發表了題為“Harnessing a single molecule for dual bioorthogonal regulation of RNA function and m6A methylation” 的突破性研究成果 ——CliPEdit 策略，首次在單一分子上實現生物正交連接（Click OFF）與光控切割（Light ON）的雙功能調控，為復雜生物系統中 RNA 多位點動態調控開辟全新路徑。

一、CliPEdit核心策略：三步可逆調控

研究團隊設計并合成了關鍵化學試劑 BANEIC（含雙疊氮基團與光裂解硝基苯基團）和 t-DBCO（三價DBCO交聯劑），通過三步調控實現 ON → OFF → ON 的RNA功能切換：

Step1. ON 態：BANEIC修飾RNA：使其同時具備—點擊化學（click chemistry）可連接性（含疊氮基）、光可裂解性（含硝基苯基團）。修飾后 gRNA 功能正常，靶向寫入 m?A；

Step2. OFF態：加入 tDBCO，通過 SPAAC 點擊反應交聯 gRNA，空間位阻使其徹底失活，m?A甲基化關閉；

Step3. RE-ON態：365 nm 光照切斷光降解基團，移除修飾，gRNA 功能完全恢復，甲基化重啟。

圖1. CliPEdit策略雙正交調控 RNA 甲基化

二、實驗驗證：從分子到細胞功能的全方位確證

研究團隊設計了系統性的驗證實驗，充分證明了CliPEdit策略的可靠性。

1. 體外結構調控

BANEIC修飾的sg-Gapdh在凝膠中表現出特征性的遷移率降低和條帶展寬，t-DBCO處理后，修飾sgRNA發生交聯，滯留在凝膠孔中，365 nm光照8分鐘后，條帶遷移率恢復至接近天然sgRNA水平。

2. 活細胞成像驗證

使用FAM標記的R-21nt探針，在HEK293T細胞中實時觀察調控過程，BANEIC修飾不影響RNA的細胞內行為；DBCO-Cy5處理后，僅BANEIC修飾的RNA顯示Cy5熒光，證明點擊反應高效發生；光照后Cy5信號顯著減弱，證實光裂解成功。

圖2. 介導RNA原位生物正交反應的調制策略驗證（活細胞成像）

3. 位點特異性m6A甲基化精準調控

研究團隊靶向多個內源性低甲基化位點：Actb A1216、Gapdh A690、Foxm1 A3488/A3504。

通過優化BANEIC修飾時間（3-7小時）和t-DBCO濃度（1-8 μM），結果如下：

SELECT和MeRIP-qPCR均顯示：以上位點的m6A水平顯著升高；而t-DBCO處理后，甲基化水平完全回歸內源性基線；365 nm光照后，甲基化活性全面恢復，實現真正的ON-OFF-ON循環控制。

圖3. CliPEdit策略調控dCas9介導的位點特異性RNA m6A甲基化

4. 生物學功能調控驗證

mRNA穩定性：Actb A1216位點m6A修飾顯著降低mRNA穩定性，該效應可通過CliPEdit策略可逆調控。

蛋白表達：Foxm1位點甲基化導致FOXM1蛋白表達下調，t-DBCO"關閉"后蛋白恢復，光照"開啟"后再次下調。

選擇性調控多個RNA：共轉染不同gRNA，可獨立控制多個RNA位點的甲基化狀態；對非靶向位點無影響，證明高特異性。

圖4. CliPEdit策略調控M3M14 - dCas9介導的RNA m6A甲基化功能

5. dCas13b系統拓展應用

該研究團隊成功將CliPEdit策略應用于無需PAM序列的dCas13b-M3M14系統，同時在更短的crRNA上實現同等高效的甲基化調控，進一步驗證了CliPEdit策略的普適性和模塊化特征。

三、研究意義與展望

CliPEdit 策略的提出，讓RNA功能調控從傳統“單向開關”模式邁入可編程多步驟調控新階段。該策略首次在單一分子框架內整合生物正交連接與光控裂解，實現RNA結構的可逆循環調控；同時適用于dCas9和dCas13系統，具有廣泛適用性；為解析單個m6A位點的動態功能、研究RNA修飾與細胞命運的因果關系提供了不可替代的工具。

四、翌圣試劑：助力RNA表觀研究，頂刊數據精準可復現

在這項研究中，涉及大量的m6A水平定量檢測和mRNA表達分析，對實驗數據的準確性和重復性提出了極高要求。研究團隊選擇了翌圣生物（YEASEN）的兩款核心產品，為整個研究提供了堅實可靠的分子檢測支持。

?? 11142ES｜Hifair^® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

本研究中，所有反轉錄步驟均由11142ES完成，為MeRIP-qPCR和mRNA穩定性分析提供了純凈的cDNA模板。

核心優勢：

?? 操作簡便：基因組去除和反轉錄一步完成；

?? 合成出色：不同GC含量基因反轉錄表現出色；

?? 高靈敏度：樣品檢出率高，最高靈敏度可達1 pg。

?? 11201ES｜Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox )

全文SELECT qPCR、MeRIPqPCR、mRNA 穩定性檢測唯一熒光定量試劑，支撐所有量化數據產出。

核心優勢：

?? 即用型：僅需加模板和引物，操作極簡，污染風險低；

?? 精準定量：在寬廣定量區域內保持良好線性關系，確保qPCR結果準確可靠；

?? 穩定可靠：歷經市場長期驗證，性能穩定可靠，廣受科研用戶信賴。

相關產品推薦