嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞治療技術(shù)近年來(lái)在臨床上不斷取得突破，特別是靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在治療B細(xì)胞來(lái)源的血液腫瘤上取得了令人矚目的成果，使其成為了當(dāng)下CAR-T細(xì)胞治療中最熱門(mén)的靶點(diǎn)。在CD19 CAR-T細(xì)胞開(kāi)發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中，CD19 CAR表達(dá)情況的檢測(cè)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前，針對(duì)CD19 CAR的檢測(cè)多采用聚合酶鏈反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)。
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下面，小編就以今年2月MacLeod et al.在Molecular Therapy發(fā)表的一篇關(guān)于基因編輯同種異體CD19 CAR-T制備方法優(yōu)化的文章（Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells）為例，為大家簡(jiǎn)要解讀如何利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19 CAR-T細(xì)胞。
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首先，我們來(lái)了解一下文章中CD19 CAR-T細(xì)胞的構(gòu)造。 CD19 CAR-T細(xì)胞的核心部件為CD19 CAR，主要由CD19的單鏈抗體（克隆號(hào)：FMC63）片段（ScFv）、CD8a的鉸鏈和跨膜區(qū)、共刺激分子4-1BB和CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)串聯(lián)而成（見(jiàn)圖1）。
圖1 CD19 CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖
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CD19 CAR 作為CD19 CAR-T細(xì)胞的核心部件，其表達(dá)情況決定了CD19 CAR-T細(xì)胞制備的成敗。文章中MacLeod et al.就是通過(guò)檢測(cè)CD19 CAR的表達(dá)來(lái)評(píng)估基因編輯同種異體CD19 CAR-T細(xì)胞制備成功率。
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接下來(lái)，我們就來(lái)看一看文章中是如何利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19 CAR的表達(dá)的。
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流式細(xì)胞儀：BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)
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主要試劑：生物素標(biāo)記的CD19-Fc蛋白 (Cat.# CD9-H8259) 購(gòu)自ACROBiosystems公司，PE標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-PE）和anti-CD3-BV711抗體購(gòu)自BioLegend公司。
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檢測(cè)樣品：Mock nucleofected T細(xì)胞組 和TRC1-2 nucleofected T細(xì)胞組
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檢測(cè)原理：生物素-親和素系統(tǒng)、抗原-抗體系統(tǒng)和流式細(xì)胞分析技術(shù)相結(jié)合（見(jiàn)圖2）。
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圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面CD3分子和CD19 CAR表達(dá)的原理示意圖
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檢測(cè)簡(jiǎn)要流程：
第一步：利用CD19 CAR能特異性結(jié)合CD19蛋白的特性，如果待檢T細(xì)胞正常表達(dá)了CD19 CAR，生物素標(biāo)記的CD19-Fc蛋白就能被標(biāo)記到待檢T細(xì)胞表面；
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第二步：利用生物素能特異性結(jié)合親和素（Streptavidin-PE）和Anti-CD3--BV711抗體能特異性結(jié)合CD3分子的特性，如果待檢T細(xì)胞表面有生物素和CD3分子，鏈霉親和素上的PE和Anti-CD3抗體上的BV711熒光標(biāo)記就能被標(biāo)記到待檢T細(xì)胞表面；
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第三步：制備好的單細(xì)胞懸液上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
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檢測(cè)結(jié)果：利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩組待檢T細(xì)胞表面CD3分子和CD19 CAR表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果顯示，CD3陰性T細(xì)胞群中CD19 CAR表達(dá)的比例要高于CD3陽(yáng)性T細(xì)胞群。
圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19 CAR-T細(xì)胞表面CD3分子和CD19 CAR表達(dá)情況
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流式細(xì)胞術(shù)作為一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等諸多優(yōu)勢(shì)，而生物素-親和素系統(tǒng)的高親和力牢固結(jié)合和多級(jí)放大效應(yīng)，在與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合使用時(shí)，使得細(xì)胞定量分析更加靈敏簡(jiǎn)便。
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ACROBiosystems作為全球**的蛋白產(chǎn)品生產(chǎn)商，擁有專(zhuān)業(yè)化的生物素標(biāo)記平臺(tái)，專(zhuān)注于為腫瘤免疫治療領(lǐng)域提供高品質(zhì)生物素標(biāo)記蛋白產(chǎn)品。
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參考文獻(xiàn)：
[1] MacLeod et al., Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.02.005
相關(guān)產(chǎn)品：
Biotinylated Human CD19, Fc Tag, ultra sensitivity (primary amine labeling) Cat.# CD9-H8259 （點(diǎn)擊可查看該產(chǎn)品信息）