腫瘤微環境(TME)是一個復雜的生態系統，不僅包含多種細胞類型，如腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞等，還包括附近區域內的細胞間質、微血管以及浸潤在其中的生物分子。 (1) 旨在增強免疫激活的免疫療法，尤其是免疫檢查點抑制劑雖然表現出引人注目的臨床療效，但大多數患者表現為新生或適應性耐藥，整體療效仍不令人滿意。
近來多項研究表明免疫細胞間及免疫細胞與其他細胞間的空間互作在很大程度上決定了抗腫瘤免疫應答強度，與腫瘤進展和臨床預后密切相關。
2021年11月8日，山東大學基礎醫學院馬春紅教授團隊在Molecular Therapy（IF=11.454）上發表文章。該研究從全新的空間角度描繪了Tim-3/Tim-3L介導的腫瘤免疫微環境互作網絡，揭示了CD4 T細胞在其調控腫瘤進程中的關鍵性作用，為優化靶向Tim-3的腫瘤免疫治療策略提供了新思路。
Tim-3是目前已知的免疫檢查點分子之一，表達于多種免疫細胞上，通過與不同的Tim-3配體（Tim-3L）相互作用發揮多樣的免疫調節功能，已成為腫瘤免疫治療的重要靶點。然而， 目前對于Tim-3/Tim-3L互作介導的細胞社會學網絡及其對腫瘤進展的影響尚不明確。
本研究利用多色免疫熒光染色分析了TME中Tim-3/Tim-3L的空間分布特征，發現Tim-3高表達于多種腫瘤浸潤淋巴細胞，且腫瘤實質區中Tim-3+CD4+細胞的比例與患者生存率顯著負相關；Tim-3L在腫瘤組織中的表達顯著升高，與Tim-3水平顯著正相關，且Tim-3L+細胞臨近的CD4 T細胞表達更高水平的Tim-3。動物實驗和臨床標本檢測進一步證實，CD4 T細胞在Tim-3抗體介導的抗腫瘤效應中發揮關鍵作用，并參與Tim-3阻斷對腫瘤相關CD8 T和NK細胞功能的促進作用。
實驗部分
實驗部分采用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統肝細胞癌(HCC)組織芯片樣本（TMA）進行多色熒光圖像采集，并且通過StrataQuest定量分析軟件對腫瘤組織和癌旁組織中不同類型的細胞數量比例，陽性率以及空間位置分布進行精準定量，文章對圖像的獲取與數據分析進行了詳細的描述。
l TMA 1 （93例癌組織和87例癌旁組織，CD4，CD8，CD56，Tim-3）
l TMA 2 （100例癌組織和97例癌旁組織，CD3，CD4，HepPar-1，Tim-3，Tim-3 Fc）
1 使用20X物鏡對識別的組織區域進行全景掃描成像。根據每個單通道染色的樣本建立光譜庫，后結合專業的光譜拆分算法消除背景和自發熒光的干擾。
2 利用TG**單細胞識別技術精準識別組織中的單個細胞核，同時識別到所有通道蛋白，并對其進行表達與分布的數據分析。
3 采用AI Clissifier功能對組織中的腫瘤區域和間質區域進行自動劃分。
4 空間表型分析，利用**算法定義每個區域圖像的細胞微環境，設立小于1個像素的閾值定義為細胞與細胞相互相鄰或接觸，將統一的算法和每個通道的閾值應用于TMA的所有樣本，對各標記物的表達和熒光水平進行標準化分析。
圖1
Tim-3+CD4+細胞的空間分布與患者預后不良相關
(A)多重免疫熒光HCC樣本圖像