紅細(xì)胞生成島（Erythroblastic
islands，EBIs）是骨髓中的特定結(jié)構(gòu)，包括中央巨噬細(xì)胞，在終末分化的不同階段被紅細(xì)胞前體包圍。但在腫瘤中從未被發(fā)現(xiàn)具有功能。肝母細(xì)胞瘤(HB)是兒科最常見的肝臟惡性腫瘤，需要更有效、更安全的治療方法來預(yù)防疾病進(jìn)展和并發(fā)癥對(duì)幼兒的終生影響。然而，由于缺乏對(duì)腫瘤微環(huán)境的全面了解，此類療法的開發(fā)受到阻礙。
2023年5月16日，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究與小兒外科聯(lián)合在Cell Reports Medicine 上發(fā)表了題為“Intratumoral
erythroblastic islands restrain anti-tumor immunity in hepatoblastoma”的研究論文。本研究提供了乙肝免疫微環(huán)境的單細(xì)胞圖譜，確定了EBI在調(diào)節(jié)免疫抑制的腫瘤免疫微環(huán)境中的作用。
通過對(duì)13個(gè)未接受治療的HB患者進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了一種免疫特征，由VCAM1+巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞形成的EBIs的異常積累，且與HB的生存率呈負(fù)相關(guān)。紅系細(xì)胞通過LGALS9/TIM3軸抑制樹突狀細(xì)胞(DC)的功能，導(dǎo)致抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答受損。但是，TIM3阻斷緩解了紅細(xì)胞對(duì)DCs的抑制作用。該研究提供了一種由腫瘤內(nèi)EBIs介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制，并提出TIM3作為HB的一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。該結(jié)果可能有助于開發(fā)更安全、更有效的免疫療法來治療患有乙肝的兒童。
實(shí)驗(yàn)部分
1 本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統(tǒng)HB組織樣本進(jìn)行多色熒光圖像采集。利用光譜庫(kù)進(jìn)行光譜拆分，獲得單通道熒光信號(hào)。DAPI通道識(shí)別單細(xì)胞。以細(xì)胞核為中心，根據(jù)每個(gè)蛋白的染**況設(shè)定距離半徑，得到每個(gè)蛋白的熒光染色信號(hào)。然后，根據(jù)每個(gè)通道的染**況設(shè)定閾值，劃分陽性細(xì)胞群，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。
2 利用Tissue Cytometry技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行空間共定位分析。計(jì)算感興趣的細(xì)胞之間的距離和每對(duì)細(xì)胞表型的相互鄰居的數(shù)量(最大距離為25 mm)。為了調(diào)節(jié)紅系細(xì)胞的密度，我們計(jì)算半徑25 mm范圍內(nèi)LGALS9+紅系細(xì)胞周圍TIM3+DC的密度，然后除以腫瘤內(nèi)LGALS9+紅系細(xì)胞的密度。從而得到每個(gè)LGALS9+紅系細(xì)胞附近TIM3+DC的數(shù)量。
3 Flow Cytometry技術(shù)專注于對(duì)液流中單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的量化分析，但是無法獲得組織原位的細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞分布關(guān)系；Tissue Cytometry技術(shù)基于全景多光譜成像的技術(shù)原理，可以獲得組織原位單細(xì)胞量化分析的同時(shí)，不但分析目標(biāo)精確到細(xì)胞核/質(zhì)等亞細(xì)胞水平的精度，更可以通過其與腫瘤的空間分布關(guān)系，對(duì)目標(biāo)在真實(shí)生物體中的位置作用進(jìn)行量化分析。
本文作者聯(lián)合使用Flow Cytometry技術(shù)和Tissue Cytometry技術(shù)，針對(duì)體外/體內(nèi)的目標(biāo)紅系細(xì)胞分別進(jìn)行了細(xì)胞數(shù)量與熒光強(qiáng)度的對(duì)比分析，尤其是在Tissue Cytometry技術(shù)中，更獲得了TME原位空間表型分析數(shù)據(jù)，結(jié)合TSA多重免疫熒光技術(shù)，對(duì)LGALS9 +紅系細(xì)胞和 TIM3 + DC之間的空間作用關(guān)系進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)了一種以EBI異常積累為特征的免疫環(huán)境的存在，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
Fig 1 VCAM1+巨噬細(xì)胞與紅系細(xì)胞形成EBIs
(F) 乙肝腫瘤的多重免疫熒光圖像，箭頭指向EBI結(jié)構(gòu)，由CD68+VCAM1+巨噬細(xì)胞和周圍的CD45-Gypa+紅系細(xì)胞組成。
(G) HB腫瘤及鄰近肝臟樣本中紅系細(xì)胞與VCAM1+巨噬細(xì)胞的距離(左)和紅系細(xì)胞與VCAM1+巨噬細(xì)胞的比例(≤25 um)。
Fig 2 腫瘤內(nèi)紅系細(xì)胞通過LGALS9/TIM3軸抑制DC的抗腫瘤功能
(D) HB腫瘤的多色免疫熒光染色圖像，顯示紅系細(xì)胞(LGALS9+Gypa+，用紅色箭頭標(biāo)記)與DC(CD11c+TIM3+，用橙色箭頭標(biāo)記)之間的相互作用。