第1階段  樣品制備和固定

樣品的固定是 ICC 實(shí)驗(yàn)和儲(chǔ)存過程中維持細(xì)胞形態(tài)的重要步驟。

對(duì)于蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞

在此過程中，細(xì)胞在固定前直接培養(yǎng)在蓋玻片上。

所需材料

− 標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片或多孔板

− 無菌PBS

− 用于包被的蛋白質(zhì)（例如聚-L-賴氨酸）

− 無菌水

步驟

1. 制備包被溶液并過濾——必要時(shí)滅菌。

提示 ：不同的樣品類型可能需要不同的蛋白質(zhì)來幫助粘附。典型的包被溶液是在 PBS 中添加聚-L-賴氨酸 (PLL)、聚-D-賴氨酸 (PDL) 或明膠制備而成。請(qǐng)參閱文獻(xiàn)了解您感興趣的細(xì)胞類型和推薦的包被蛋白濃度。

2. 用包被溶液覆蓋玻片或平板。

室溫下孵育時(shí)間通常為1小時(shí)至24 時(shí)。

提示： 將蓋玻片放入組織培養(yǎng)板的孔中，并用包被液覆蓋。

3. 用無菌 PBS沖洗蓋玻片3次。

提示： 這是為了確保去除蓋玻片上的游離蛋白質(zhì)。

4. 讓蓋玻片完全干燥。如果需要，在紫外線下消毒至少4小時(shí)。

警告：或者，蓋玻片可以在包被之前用 70% 乙醇清洗，并在整個(gè)過程中使用無菌溶液。

5. 在包被的蓋玻片或平板上培養(yǎng)細(xì)胞。

6. 確定細(xì)胞總數(shù)并檢查細(xì)胞活力。

一般來說，存活率應(yīng)為 90 - 95%。

7. 準(zhǔn)備固定劑，并用選定的固定劑孵育細(xì)胞。

提示：乙醇、甲醇和丙酮會(huì)使細(xì)胞透化，因此使用這些固定劑前通常不需要另外透化。較長(zhǎng)的孵育時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致較高程度的固定，直至表位可能過度固定。孵育時(shí)間短可能會(huì)導(dǎo)致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時(shí)間需要憑經(jīng)驗(yàn)確定。

8. 用洗滌緩沖液清洗細(xì)胞 3 次。

提示：理想情況下，固定后盡快進(jìn)行染色。但樣品可以保存在 0.1% 疊氮化鈉/PBS 中，在 4°C下保存 1-2 周。較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間可能會(huì)緩慢地逆轉(zhuǎn)固定，導(dǎo)致形態(tài)較差和表位保存不良。

對(duì)于懸浮細(xì)胞

對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以在將懸浮液培養(yǎng)到載玻片上之前洗滌并固定細(xì)胞。

所需材料

− 細(xì)胞懸液

− 聚苯乙烯圓底 12 × 75 mm 2 個(gè)Falcon 管/96 孔板（或任何與您的離心機(jī)兼容的容器）

− 懸浮液/洗滌緩沖液（例如PBS）

步驟

1. 根據(jù)廠商的指導(dǎo)收獲和洗滌細(xì)胞。

2. 確定細(xì)胞總數(shù)，并檢查細(xì)胞活力。

一般來說，存活率應(yīng)為90 - 95%。

3. 離心，并在冰冷的懸浮緩沖液中重懸細(xì)胞樣品。

3.1. 在4°C下以約 200 xg 離心5分鐘。

提示：旋轉(zhuǎn)時(shí)間和速度可能需要優(yōu)化。

4. 準(zhǔn)備固定劑，并用選定的固定劑孵育細(xì)胞。

提示：乙醇、甲醇和丙酮會(huì)使細(xì)胞透化，因此使用這些固定劑前通常不需要另外透化。較長(zhǎng)的孵育時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致較高程度的固定，直至表位可能過度固定。孵育時(shí)間短可能會(huì)導(dǎo)致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時(shí)間需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

5. 用洗滌緩沖液清洗細(xì)胞3次。

5.1. 將細(xì)胞離心成沉淀（200 xg，5分鐘，4°C）。

5.2. 每次洗滌后去除上清液并重新懸浮沉淀。

提示：理想情況下，固定后盡快進(jìn)行染色。但樣品可以保存在 0.1% 疊氮化鈉/PBS 中，在4°C下保存 1-2 周。較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間可能會(huì)緩慢地逆轉(zhuǎn)固定，導(dǎo)致形態(tài)較差和表位保存不良。

6. 將約10 µL懸浮細(xì)胞移至載玻片上。

使用的最佳細(xì)胞密度取決于所使用的細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)要求。

此時(shí)的典型密度為 10 6 - 10 7 個(gè)細(xì)胞/mL。

第 2 階段  透化（可選）

透化作用將部分溶解細(xì)胞膜，使抗體能夠到達(dá)細(xì)胞內(nèi)表位。如果 PFA 用作固定劑，則尤其需要這樣做。甲醇等有機(jī)溶劑通常會(huì)同時(shí)透化和固定細(xì)胞，因此使用有機(jī)溶劑作為固定劑時(shí)并不嚴(yán)格要求透化。

所需材料

− 經(jīng)過相關(guān)固定步驟的樣品

− PBS

− 洗滌劑（見表1）

− 疏水屏障筆（可選）

步驟

所需時(shí)間約20分鐘。

1. 根據(jù)以下步驟，用 PBS 稀釋洗滌劑來制備透化溶液：

表 1：透化用洗滌劑

警告： Triton X-100 是最常用的用于提高抗體滲透性的去污劑。然而，它通常不太適合膜相關(guān)抗原，因?yàn)樗芙饽ぜ捌湎嚓P(guān)蛋白。最佳的去垢劑取決于蛋白質(zhì)及其定位。

應(yīng)針對(duì)所使用的樣品優(yōu)化去污劑的濃度和孵育時(shí)間。

如果樣品在載玻片上，您可以用PAP筆圈出細(xì)胞樣品，以幫助匯集試劑。

2. 用透化溶液覆蓋細(xì)胞并在室溫下孵育 2-5 分鐘。

提示：如果樣品位于載玻片上，您可以用 PAP筆圈出細(xì)胞樣品，以幫助匯集試劑。

3. 用 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次。

第三階段  封閉

在 ICC 中，封閉步驟對(duì)于防止圖像中的高背景染色特別重要。典型的封閉劑是與二抗宿主物種或BSA相對(duì)應(yīng)的2-10%血清蛋白溶液，其物種依賴性較小，但封閉效率可能較低。封閉液不應(yīng)含有一抗宿主動(dòng)物的血清，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致高背景。

所需材料

− 已經(jīng)歷相關(guān)固定和透化步驟的樣品

− 蛋白封閉劑

− 二抗宿主物種的正常血清

− 牛血清白蛋白（例如，B265991）

− PBS（例如P492453）

− 甘氨酸

步驟

所需時(shí)間約2小時(shí)。

1. 準(zhǔn)備封閉緩沖液。

1.1. 將所選的蛋白質(zhì)封閉劑溶解在PBS中至2-10 % w/v。

1.2. 加入濃度為0.1 M的甘氨酸（可選）。

2. 通過在封閉緩沖液中孵育細(xì)胞來封閉細(xì)胞。

室溫孵育1-2 h

警告：如果樣品位于載玻片上，您可以用PAP筆圈出細(xì)胞樣品，以幫助匯集試劑。

3. 繼續(xù)抗體孵育。

第4階段  抗體孵化

執(zhí)行必要的封閉步驟后，您現(xiàn)在就可以用抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色了。通常有兩個(gè)原則：(i) 直接 ICC，其中一抗直接與熒光團(tuán)綴合，以及 (ii) 間接 ICC，其中使用合適的熒光標(biāo)記二抗檢測(cè)一抗。兩種方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，這里將更詳細(xì)地討論。間接 ICC 是最常用的協(xié)議。

多色 ICC 涉及使用兩組或多組抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，以揭示兩種或多種感興趣蛋白質(zhì)的分布或共定位。下面給出的間接和直接協(xié)議均可適用于多色 ICC。如果間接 ICC 用于多色，強(qiáng)烈建議使用預(yù)吸附二抗。這些抗體針對(duì)其他物種進(jìn)行了預(yù)吸附，從而最大限度地減少了所用二抗與來自不同物種的一抗發(fā)生交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)。

間接法

所需材料

− 已經(jīng)歷相關(guān)透化/封閉步驟的細(xì)胞

− 抗體稀釋緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如 T434505、P196391）

− 洗滌緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如T434505、P196391）

− 一抗

− 偶聯(lián)二抗

− 疏水性屏障筆——可選用于載玻片或蓋玻片上的小細(xì)胞體積

步驟

所需時(shí)間約13小時(shí)30分鐘。

1. 確定要使用的最佳抗體稀釋度。然后用抗體稀釋緩沖液稀釋抗體。

抗體數(shù)據(jù)表上通常會(huì)建議最佳稀釋度。

警告：您應(yīng)該進(jìn)行稀釋以確定最有效的抗體濃度。

抗體稀釋緩沖液可以僅為PBS。稀釋緩沖液還可能含有 0.1% Tween（以降低表面張力）和 1% BSA（作為額外的封閉劑以減少非特異性結(jié)合）。

2. 將樣品在預(yù)稀釋的一抗中孵育。

室溫孵育 2 小時(shí)，或4°C過夜

警告：孵育時(shí)間和溫度可能需要優(yōu)化。

提示 1：抗體溶液需要完全覆蓋您的樣品。

提示 2：使用疏水性屏障筆有助于容納小體積。

3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗載玻片3次。

4. 在抗體稀釋緩沖液中制備二抗，并將樣品浸入預(yù)稀釋的二抗中。

室溫孵育1小時(shí)。

提示 ：可能需要優(yōu)化孵育時(shí)間和抗體濃度。典型的二抗稀釋度為 1:1000 或 1:2000 或 0.1-2 µg/mL。對(duì)于多色實(shí)驗(yàn)，通?？梢韵♂尣煌亩共⒁黄鸱跤?。如果使用熒光團(tuán)，則必須在黑暗中孵育以避免光漂白。

5. 用 PBS 或 PBS-T 清洗樣品 3 次。

6. 繼續(xù)復(fù)染、封片和成像。

直接法

所需材料

− 已經(jīng)歷相關(guān)透化/封閉步驟的細(xì)胞

− 抗體稀釋緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如  T434505、P196391）

− 洗滌緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如  T434505、P196391）

− 偶聯(lián)一抗

− 疏水性屏障筆——可選用于載玻片或蓋玻片上的小細(xì)胞體積

步驟

所需時(shí)間約12小時(shí)15分鐘。

1. 確定要使用的最佳抗體稀釋度。然后在抗體稀釋緩沖液中稀釋抗體。

提示：抗體數(shù)據(jù)表上通常會(huì)建議最佳稀釋度。如果沒有，您可能需要進(jìn)行稀釋以找到最有效的抗體濃度?？贵w稀釋緩沖液可以僅為PBS。我們還建議添加 0.1% Tween（以降低表面張力）和 1% BSA（作為額外的封閉劑以減少非特異性結(jié)合）。

2. 將樣品浸入預(yù)稀釋的一抗中。

室溫孵育2小時(shí)，或4°C過夜。

警告：孵化時(shí)間可能需要優(yōu)化。

提示 1：抗體溶液需要完全覆蓋您的樣品。

提示2： 使用疏水性屏障筆可以幫助容納小體積。

3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗樣品3次。

4. 按照制造商推薦的方案完成任何適當(dāng)?shù)膹?fù)染。

第 5 階段  復(fù)染和檢測(cè)

ICC 過程的最后一步是樣品封片并檢測(cè)信號(hào)。這涉及將蓋玻片添加到載玻片上（用于蓋玻片上的細(xì)胞培養(yǎng)物），或?qū)⑸w玻片覆蓋到樣本上，以實(shí)現(xiàn)成像。

典型的細(xì)胞核復(fù)染劑是 DAPI （D598342）、HOECHST 33342 （H288601） 或 DRAQ7 （D266297）。還有一些細(xì)胞器或細(xì)胞骨架復(fù)染劑可用（P287444） 。

所需材料

− 用熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體染色的細(xì)胞

− 熒光復(fù)染劑（可選，例如：DAPI D598342）

− 適用于熒光檢測(cè)的封固劑（適用于蓋玻片或載玻片上的細(xì)胞）

− 密封劑（用于蓋玻片或載玻片上的細(xì)胞，例如：指甲油）

− PBS（適用于孔中的細(xì)胞，例如 P492453）

− 熒光顯微鏡

步驟

1. 如果需要，將樣品浸入復(fù)染溶液中。

1.1. 根據(jù)制造商的指導(dǎo)在室溫下孵育，或直至觀察到所需的顏色。

提示：某些封固劑含有熒光復(fù)染劑（參見 H288601）。這樣就無需單獨(dú)對(duì)載玻片進(jìn)行復(fù)染以添加封固劑。

2. 封固您的樣品。

提示：封片劑通常含有抗淬滅劑，有助于更長(zhǎng)時(shí)間地保存熒光。

3. 使用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)/發(fā)射濾光片組和/或激光器對(duì)樣品進(jìn)行成像。

如需了解更多產(chǎn)品詳情，請(qǐng)前往阿拉丁官網(wǎng)查詢。

阿拉丁:https://www.aladdin-e.com/