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         細胞凍存是一種將細胞在低溫條件下保存的方法，目的是在長時間內保持細胞的活性和功能。這種方法對于細胞系的長期保存、實驗重復性、基因庫的建立以及細胞治療的儲備等都具有重要意義。通過凍存，可以減少細胞在傳代過程中的遺傳變異，避免因污染、環境變化或實驗操作失誤導致的細胞損失。最佳的冷凍保存時機是在細胞處于最佳生長速度時。

         冷凍保護劑是細胞凍存中的關鍵成分，常用的冷凍保護劑包括二甲基亞砜（DMSO）和甘油。這些保護劑的主要作用是降低溶液的冰點，減少冰晶的形成，從而保護細胞免受冰晶的機械損傷。DMSO是一種常用的冷凍保護劑，適用于大多數細胞類型，但某些細胞對DMSO敏感，此時可以使用甘油作為替代品。

第 1 階段   冷凍保存

實驗步驟

1.在冷凍管上標記日期、研究人員姓名、細胞編號、傳代數和細胞類型（以及任何其他有用信息，例如基因改造）。

2.如果是貼壁細胞，先除去細胞培養基，用PBS清洗，添加適量的胰蛋白酶以覆蓋細胞，并在37°C培養箱中孵育約2分鐘（具體孵育時間應根據實際培養的細胞類型決定）。

         添加等量的培養基終止消化作用，用移液槍輕輕吹打細胞，將貼壁細胞沖洗下來，并轉移到50 mL Falcon管中。

3.對于懸浮培養細胞，將所需體積的細胞直接轉移到50 mL Falcon管中。

4.使用血細胞計數器計數細胞以確定其活力。冷凍保存的細胞活力應至少為75%。

5.室溫下以300 × g離心5分鐘。

6.準備冷凍培養基（見表1）。

         表 1. 不同哺乳動物細胞系適用的凍存培養基配方：

         使用前混合均勻并加熱至 37°C。

         冷凍培養基含有必需的冷凍保護劑，例如二甲基亞砜（DMSO），以防止形成可能損害細胞膜和成分的細胞內和細胞外冰晶。

         注意，DMSO并不適合所有細胞類型，有些情況下，可以使用甘油作為替代品。

7.除去上清液。

8.加入凍存培養基至所需細胞密度。

         對于哺乳動物細胞，該濃度通常為 1×106/mL 凍存液。細胞在凍存液中在室溫下放置的時間不應超過10分鐘。

9.將1 mL樣品分裝到冷凍管中，并蓋緊蓋子。

10.將冷凍管轉移至室溫的冷凍盒中，再放入-80°C的冰箱。冷凍盒外周添加適量異丙醇，確保溫度以每分鐘1°C的速度穩定下降。

         由于冷凍前，會有較多的水流出，因此緩慢的冷凍過程（每分鐘-1ºC）有助于防止細胞內冰晶的形成。

11.約24小時后，從冷凍盒中取出冷凍管并轉移到液氮中長期儲存。

         一般冷凍的細胞可以在液氮中保存數年。理想情況下，冷凍細胞不應在-80ºC下保存很長時間（最多一周），并且應盡快轉移到液氮中。在-80ºC下長期儲存細胞可能會損害細胞活力。

第 2 階段   解凍冷凍細胞系

實驗步驟

1.從液氮儲存器中取出冷凍管。快速放入37°C水浴中，直至解凍約80%（請勿在室溫下解凍）。此過程不應超過1分鐘。

         因為緩慢的解凍過程會對細胞造成損壞，所以細胞通常應盡快解凍。

         同時，冷凍保護劑DMSO具有一定的細胞毒性，因此細胞應以比室溫下更快的速度解凍，以便快速稀釋和去除DMSO。

         快速解凍細胞的另一個目的是防止冷凍過程中形成的任何晶體損壞細胞膜或成分。

2.使用移液器將冷凍管中的物質轉移到含有約10 mL預熱培養基的15 mL Falcon 管中。

3. 300 × g離心5分鐘，棄上清液，用適量培養基重懸細胞沉淀。

4.將細胞懸液轉移到培養容器中。然后轉移到37°C培養箱中，培養。

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