編者按
近年來(lái)，肌肉萎縮癥的關(guān)注度逐漸增加。在肌肉萎縮癥中，肌肉營(yíng)養(yǎng)障礙、肌肉纖維變細(xì)甚至消失等導(dǎo)致的肌肉體積縮小，造成嚴(yán)重的痛苦和過(guò)早死亡，其早期診斷和治療至關(guān)重要。目前，對(duì)肌肉營(yíng)養(yǎng)不良的固有抵抗力背后的機(jī)制仍然未知。
2024年3月2日，Umeå大學(xué)的一項(xiàng)關(guān)于肌肉萎縮癥的一篇題為“fhl2b mediates extraocular muscle protection in zebrafish models of muscular dystrophies and its ectopic expression ameliorates affected body muscles”的研究論文發(fā)表在nature communications期刊上，該研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析證明了斑馬魚(yú)EOMs和軀干肌肉對(duì)肌肉營(yíng)養(yǎng)不良反應(yīng)的基因表達(dá)的重要差異，同時(shí)證明了Fhl2是一種保護(hù)因子，是治療肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的候選靶基因。
文章題目
fhl2b mediates extraocular muscle protection in zebrafish models of muscular dystrophies and its ectopic expression ameliorates affected body muscles
雜志：《Nature Communications》（IF=16.6）
發(fā)表時(shí)間：2024.3.2
作者：Nils Dennhag, Abraha Kahsay等
單位：Umeå大學(xué)等
研究成果01
由40多種基因突變引起的肌肉萎縮癥具有相似的特征，包括導(dǎo)致肌肉無(wú)力的肌纖維斷裂、行動(dòng)能力喪失以及主要由呼吸衰竭引起的過(guò)早死亡。肌營(yíng)養(yǎng)不良最常見(jiàn)的形式是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)。肌肉萎縮癥影響全球新生兒，引起明顯痛苦，但目前治療方案很少，無(wú)治愈方法。因此，需要新的有效治療方案，延長(zhǎng)和改善患有此疾病患者的生活質(zhì)量。
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)來(lái)研究肌肉萎縮癥如何影響眼部肌肉，通過(guò)使用獲得諾貝爾獎(jiǎng)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在斑馬魚(yú)身上創(chuàng)建了新的遺傳疾病模型。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證明了基因表達(dá)的重要差異，作為斑馬魚(yú)EOM和軀干肌肉之間肌肉萎縮的反應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)LIM蛋白Fhl2響應(yīng)于結(jié)蛋白、凝集素和隱蔽蛋白的敲除而增加，這些細(xì)胞骨架蛋白的敲除會(huì)導(dǎo)致不同的肌肉營(yíng)養(yǎng)不良，并有助于EOM的疾病保護(hù)。此外，還發(fā)現(xiàn)fhl2的異位表達(dá)可以部分挽救斑馬魚(yú)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥模型sapje的肌肉表型，顯著提高其存活率。因此，F(xiàn)hl2 是一種保護(hù)劑，也是治療肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的候選靶基因。
研究成果02
1. 斑馬魚(yú)的去纖維病模型顯示骨骼肌缺陷
為了研究非致命性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥背景下的眼外肌（EOMs），研究人員構(gòu)建了desma+/-;desmb+/-斑馬魚(yú)，其兩個(gè)基因的外顯子1中均有提前終止密碼子。
這些突變導(dǎo)致截短的結(jié)蛋白缺乏α螺旋桿結(jié)構(gòu)域，而螺旋桿結(jié)構(gòu)域?qū)τ诼菪纬珊腿?jí)結(jié)構(gòu)形成至關(guān)重要。我們確認(rèn)了 desma −/− ;Desmb −/− 雙突變體，與Desma +/- 不同;Desmb+/- 對(duì)照組在3 dPF時(shí)缺乏Desmin免疫標(biāo)記（圖S1c）。幼蟲(chóng)在第4天和第5天之間在1%甲基纖維素中飼養(yǎng)，以產(chǎn)生游泳阻力。這引發(fā)了顯著的肌纖維分離和斷裂，兩者都在 desma −/− 中;desmb −/− 突變體和desma −/− 單突變體，在 10–12th體節(jié)水平（圖1a，b），而desmb −/− 和desma +/- ;desmb 沒(méi)有 +/- 顯示肌纖維損傷（圖 1b），表明 desma 是肌肉拉伸強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)者。
圖1 desmin的缺乏導(dǎo)致肌纖維損傷和主干肌纖維的代謝轉(zhuǎn)移
2. 斑馬魚(yú)結(jié)節(jié)病模型保留了眼外肌的完整性
去絲病患者通常在30多歲之前沒(méi)有癥狀。為了評(píng)估缺乏結(jié)蛋白是否對(duì)肌纖維身份有影響，使用針對(duì)快速肌球蛋白輕鏈（F310）和針對(duì)慢肌球蛋白重鏈1、2 和 3 （S58）的抗體對(duì)24個(gè)月齡斑馬魚(yú)的軀干和 EOM 進(jìn)行免疫標(biāo)記。斑馬魚(yú)的軀干由肌纖維組成，這些肌纖維被結(jié)締組織薄層隔開(kāi)，肌隔很容易在橫截面上識(shí)別（圖1，g，i，k，m中的虛線(xiàn)）。成年斑馬魚(yú)EOM也顯示出慢速和快速肌纖維的不同位置，盡管沒(méi)有被肌隔隔開(kāi)（圖1o，q）。desma −/− 軀干肌肉的橫截面 ;與野生型 （WT） 對(duì)照相比，desmb −/− 突變體顯示慢結(jié)構(gòu)域內(nèi)快 F310 陽(yáng)性肌纖維減少（圖 1g，h，開(kāi)放箭頭），慢肌纖維直徑減小，慢結(jié)構(gòu)域肌纖維數(shù)量顯著增加（desma +/+ ;desmb +/+ ） （圖 1I， j）。
結(jié)果表明，Desmin有助于肌纖維的完整性，并且是維持胚胎斑馬魚(yú)軀干中肌肉組織的正常功能所必需的，模型中保留了眼外肌的完整性。盡管缺乏Desmin，眼外肌的肌纖維成分仍保持不變，而軀干肌肉受到顯著影響并顯示出明顯的肌營(yíng)養(yǎng)不良跡象。
3. fhl2b 的肌肉特異性過(guò)表達(dá)顯著提高了杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良斑馬魚(yú)模型的存活率和肌纖維完整性
研究人員進(jìn)一步地對(duì)其轉(zhuǎn)錄組分析，F(xiàn)hl2b上調(diào)是眼外肌對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的反應(yīng)，并且隨著疾病進(jìn)展而在突變斑馬眼外肌中增加。
由于Fhl2是缺乏desmin的EOMs轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中唯一平行差異表達(dá)，在此研究Fhl2b是否也可以在肌肉萎縮癥中保護(hù)EOMs以外的肌肉，使用了斑馬魚(yú)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良模型sapje的肌肉表型稱(chēng)為dmd - / -。數(shù)據(jù)顯示，異位表達(dá)Fhl2b可以部分挽救斑馬魚(yú)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良模型sapje的肌肉表型，顯著提高其存活率。因此，F(xiàn)hl2是一種保護(hù)因子，是治療肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的候選靶基因。
圖2 肌肉特異性過(guò)表達(dá)fhl2b可顯著延長(zhǎng)dmd - / -斑馬魚(yú)幼魚(yú)的壽命，改善運(yùn)動(dòng)功能和肌肉完整性
4. 肌肉特異性 fhl2b過(guò)表達(dá)可改善DMD −/− 幼蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)軸突完整性和神經(jīng)肌肉接頭
為了進(jìn)一步了解fhl2b的過(guò)表達(dá)如何改善dmd −/− 表型，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析和RNA測(cè)序，并鑒定出DMD −/− 幼蟲(chóng)特有的1054個(gè)DEGs（圖3a，基因集C）。這1054 個(gè) DEG 對(duì)應(yīng)于 dmd 疾病相關(guān)基因，其表達(dá)部分被 fhl2b 過(guò)表達(dá)挽救（圖 3b）。對(duì)所有交叉點(diǎn)的基因本體分析（圖3c，圖S7a，b）揭示了DMD −/− 幼蟲(chóng)中軸突和神經(jīng)元引導(dǎo)相關(guān)術(shù)語(yǔ)的獨(dú)特富集（圖3c），其中特別包括幾個(gè)信號(hào)素基因，對(duì)軸突引導(dǎo)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活至關(guān)重要（圖3d）。
此外，mir-206（一種調(diào)節(jié)性microRNA）和組蛋白脫乙酰酶4（hdac4）在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者中均上調(diào)，并被建議作為生物標(biāo)志物 。我們測(cè)定了這些基因在系統(tǒng)中的表達(dá)，并觀(guān)察到它們?cè)赿md −/− 幼蟲(chóng)中顯著上調(diào)（圖3e，f）。然而，在 dmd −/− 中;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)，兩個(gè)基因的表達(dá)水平明顯接近同胞對(duì)照，相對(duì)而言可能表明組織更健康（圖3e，f）。測(cè)試DMD −/− 患者的軸突和神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）完整性是否得到改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)，我們使用乙酰化微管蛋白抗體和α-bungarotoxin對(duì)5 dpf幼蟲(chóng)進(jìn)行免疫標(biāo)記，分別標(biāo)記軸突和突觸后NMJ（圖3g-i，圖S8）。
與同胞對(duì)照組相比，DMD −/− 幼蟲(chóng)表現(xiàn)出細(xì)軸突，分支減少（圖3g，i，箭頭），此外，NMJ雜亂無(wú)章且支離破碎（圖5h，i箭頭），軸突和NMJ之間幾乎完全失去接觸。相比之下，dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)在正常軸突分支（圖3g）和NMJ組織（圖3i，開(kāi)箭頭）附近顯示。由于 dmd −/− NMJ 非常碎片化，我們將健康的 NMJ 定義為 α-bungarotoxin 陽(yáng)性點(diǎn)，大于最小的 WT 點(diǎn)。健康的NMJs在dmd −/− 中顯著降低，但在dmd −/− 中沒(méi)有顯著降低;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)（圖3k）。此外，與 dmd −/− 相比，dmd −/− 中的雙陽(yáng)性突觸囊泡 2 （SV2）/α-bungarotoxin NMJ 顯著減少;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）和同胞對(duì)照幼蟲(chóng)（圖3j箭頭，圖3l），表明肌纖維的神經(jīng)支配減少。
為了量化軸突的完整性，我們使用乙酰化微管蛋白免疫標(biāo)記幼蟲(chóng)的 3D 渲染測(cè)量了軸突的長(zhǎng)度（圖3m，o）和體積（圖3n，p），發(fā)現(xiàn) dmd −/− 顯著改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）與DMD −/− 幼蟲(chóng)相比。
總之，數(shù)據(jù)表明軸突回縮或降解是DMD −/− 幼蟲(chóng)中常見(jiàn)的現(xiàn)象；在通過(guò)fhl2b表達(dá)挽救的肌纖維中，軸突、NMJ、神經(jīng)支配和功能顯著改善，如游泳能力所證明的那樣，這可能是改善肌肉組織完整性的結(jié)果。
圖3 肌肉特異性過(guò)表達(dá)fhl2b改善dmd - / -斑馬魚(yú)幼魚(yú)軸突和神經(jīng)肌肉連接處的完整性
5. fhl2b的肌肉特異性過(guò)表達(dá)加速巨噬細(xì)胞活性和肌肉再生
研究人員鑒定了 78個(gè)基因在 dmd −/− 疾病背景中響應(yīng) fhl2b 過(guò)表達(dá)而差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了參與肌肉再生的基因，表明這是改善DMD −/− 肌肉完整性的可能機(jī)制;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)，并證實(shí)了 dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）肌纖維被fhl2b過(guò)表達(dá)部分挽救，以及dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）肌纖維不易脫落。
通過(guò)延時(shí)研究觀(guān)察肌肉再生發(fā)現(xiàn)，dmd −/− 有顯著改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）隨時(shí)間推移與dmd −/− 相比;Tg（503unc：EGFP）對(duì)照（圖4d，e）。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明fhl2b過(guò)表達(dá)加速了肌肉再生。
進(jìn)一步研究表明，Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲(chóng)通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞募集具有更快的肌纖維再生。
圖4. hl2b過(guò)表達(dá)導(dǎo)致dmd−/−斑馬魚(yú)幼魚(yú)再生標(biāo)記上調(diào)
編者點(diǎn)評(píng)
本篇研究表明，F(xiàn)hl2在幾種疾病模型的EOMs中上調(diào)，表明Fhl2是肌營(yíng)養(yǎng)不良癥未來(lái)治療策略發(fā)展的有力候選。此外，研究中發(fā)現(xiàn)fhl2b的誘導(dǎo)表達(dá)可以提供對(duì)肌肉萎縮癥的抗性，并且EOMs提供了一種關(guān)于保護(hù)細(xì)胞策略的新方法，基于Fhl2的治療有可能用于緩解身體肌肉組織中的肌肉萎縮癥。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開(kāi)拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚(yú)生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚(yú)、類(lèi)器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開(kāi)展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚(yú)模型及腦類(lèi)器官、心臟類(lèi)器官及各種腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢(xún)！