近年來，隨著細(xì)胞與基因治療在腫瘤攻克上表現(xiàn)出顯著療效，特別是圍繞T細(xì)胞展開的CAR-T、TCR-T、TIL等療法發(fā)揮出了優(yōu)良的腫瘤殺傷效果，因此T細(xì)胞療法市場(chǎng)迎來了大幅的增長(zhǎng)趨勢(shì)。T細(xì)胞體外擴(kuò)增與激活是核心環(huán)節(jié)，而CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠憑借其高效性和穩(wěn)定性，成為行業(yè)主流選擇。
T細(xì)胞激活通路——雙信號(hào)機(jī)制
01 第一信號(hào)：抗原特異性信號(hào)
T細(xì)胞受體（TCR/CD3）識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的MHC-抗原肽復(fù)合物，觸發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)（如鈣調(diào)蛋白、MAPK、NF-κB通路），啟動(dòng)T細(xì)胞活化。
02 第二信號(hào)：共刺激信號(hào)
APC表面的CD80/CD86與T細(xì)胞CD28結(jié)合，增強(qiáng)TCR信號(hào)，促進(jìn)IL-2分泌和抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)，防止T細(xì)胞失能。
T細(xì)胞活化增殖信號(hào)通路圖[1]
磁珠激活法原理與優(yōu)勢(shì)
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雙信號(hào)同步提供：通過將抗CD3和抗CD28抗體偶聯(lián)至磁珠表面，同時(shí)提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)和第二信號(hào)，模擬天然抗原呈遞細(xì)胞（APC）的雙信號(hào)激活模式 -
促進(jìn)免疫突觸形成：磁珠的直徑一般與APC大小相近，能促進(jìn)T細(xì)胞與磁珠形成類似免疫突觸的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)效率 -
動(dòng)態(tài)接觸：磁珠可自由移動(dòng)，與T細(xì)胞表面受體動(dòng)態(tài)結(jié)合，避免固定化抗體因空間位阻導(dǎo)致的信號(hào)弱化
近岸蛋白為CGT客戶提供GMP級(jí)CD3/CD28 beads(Cat.No.:GMP-B016)，選用直徑為 4.5μm的無孔單分散超順磁性微珠，易于磁化和退磁，操作簡(jiǎn)便易去除，確保無磁殘留風(fēng)險(xiǎn)；本產(chǎn)品采用人源化抗體原料，為人源化的 anti-CD28抗體，以及OKT3經(jīng)人源化改造而成的Anti-CD3抗體，且均經(jīng)過細(xì)胞庫(kù)檢定和病毒清除驗(yàn)證，極大降低免疫原性，提高T細(xì)胞療法臨床應(yīng)用安全性。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
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14天擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)1000倍以上
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4.5μm超順磁性微珠，操作簡(jiǎn)便易去除，無磁殘留風(fēng)險(xiǎn)
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偶聯(lián)的抗體為人源化抗體，更低的免疫原性，均經(jīng)過細(xì)胞庫(kù)檢定和病毒清除驗(yàn)證
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低內(nèi)毒素，小于0.5 EU/mL
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GMP級(jí)別，高批間一致性
數(shù)據(jù)展示
14天擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)1000倍以上，高于國(guó)內(nèi)外同類市場(chǎng)產(chǎn)品
Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads (Cat.No.:GMP-B016) , and expanded for 14 days.
激活第5天，細(xì)胞活化增殖占比99%以上
The human PBMCs were labeled with CFSE and stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads (Cat.No.:GMP-B016), and then the proliferation of cells was assessed with CFSE dilution assay by flow Cytometry on day 5 after stimulation.
激活后T細(xì)胞耗竭程度低，在 PD-1 低表達(dá)情況下可擴(kuò)增 8 天
PD-1 expression of the activated human T Cells. The human T cells were stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads (Cat.No.:GMP-B016), and expanded for 14 days.
使用建議
（1）（可選）磁珠清洗：磁珠重懸后，取適量的磁珠到新的無菌 EP 管中，加入 1mL PBS (pH7.4)重懸，混合 3-5min，置于磁力架上分離磁珠 1min，去掉上清，加細(xì)胞培養(yǎng)基重懸待用；
（2）細(xì)胞激活：將洗好的磁珠加入到已分離的 PBMC 或T細(xì)胞中，重懸到1-2×106/mL確保按照說明書推薦用量添加磁珠（見磁珠推薦使用表），置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并添加 rhIL-2（Cat.No:GMP-C013）*或rhIL-7（Cat.No:GMP-C086） + rhIL-15（Cat.No:GMP-C016）擴(kuò)增；
*單獨(dú)添加IL-2，建議使用濃度為100ng/mL，可根據(jù)實(shí)際反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整及優(yōu)化。
（3）細(xì)胞擴(kuò)增：細(xì)胞密度超過 2.5×106/mL 或者培養(yǎng)基變黃時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)器皿中并用新的含有IL-2或IL-7+IL-15的培養(yǎng)基稀釋到0.5-1×106/mL，并記錄細(xì)胞活率及擴(kuò)增倍數(shù)，培養(yǎng) 14-21 天后收集細(xì)胞。
磁珠Q&A
Q1: GMP-B016只能激活T細(xì)胞嗎，能否直接激活PBMC？
A1: 可以直接激活PBMC，并且激活14天后T細(xì)胞的占比達(dá)到95%以上。
Q2：磁珠是否具備分選功能？
A2：不具備分選功能
Q3：磁珠是否會(huì)影響流式檢測(cè)？
A3：首先，磁珠原材料采用超順磁顆粒，在非磁場(chǎng)條件包括流式檢測(cè)條件下不具備磁性不會(huì)堵塞流式機(jī)器液路；其次，磁珠尺寸均一為4.5um，低于白細(xì)胞大小，在流式前側(cè)向分布能夠和細(xì)胞顯著區(qū)分。
Q4：激活前后細(xì)胞形態(tài)變化？
A4：細(xì)胞活化除了通過活化表型檢測(cè)，在細(xì)胞形態(tài)上也會(huì)有顯著變化，激活后的T細(xì)胞尺寸變大，發(fā)生抱團(tuán)，未抱團(tuán)的細(xì)胞也會(huì)變成近水滴狀。
Q5：磁珠如何去除，如何判斷殘留？
A5：將細(xì)胞磁珠混合液置于離心管中并放在磁力架上靜置1min，保持離心管在磁力架，用移液槍吸出細(xì)胞懸液。磁珠和細(xì)胞在顯微鏡下可顯著區(qū)分，亦可在流式機(jī)器上區(qū)分。
方法一：顯微鏡觀察
方法二：流式檢測(cè)
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相關(guān)產(chǎn)品信息
| Cat.No. | Product Name |
| GMP-B016 | anti-Human CD3/CD28 Beads |
| GMP-A018 | Recombinant anti-Human CD3 mAb |
| GMP-A063 | Recombinant anti-Human CD28 mAb |
| GMP-C013 | Recombinant Human IL-2,DMF Filed |
| GMP-CD66 | Recombinant Human IL-2 |
| GMP-CD47 | Recombinant Human IL-7,DMF Filed |
| GMP-C086 | Recombinant Human IL-7 |
| GMP-C016 | Recombinant Human IL-15,DMF Filed |
參考文獻(xiàn)
[1] Demkes, Evelyne J et al. “Requirements for Proper Immunosuppressive Regimens to Limit Translational Failure of Cardiac Cell Therapy in Preclinical Large Animal Models.” Journal of cardiovascular translational research vol. 14,1 (2021): 88-99. doi:10.1007/s12265-020-10035-2