目前，確定慢性HBV（乙型肝炎病毒）感染的患者何時開始抗病毒治療是一個有爭議的問題。其中一個關(guān)鍵原因是區(qū)分慢性HBV感染自然進(jìn)程的生物標(biāo)志物開發(fā)不充分，不能滿足臨床實(shí)踐需要。
福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院研究團(tuán)隊在Materials Today Bio（IF:10.761）上發(fā)表了題為“Proteomic characterization of the natural history of chronic HBV infection revealed by tandem mass tag-based quantitative proteomics approach”的文章，揭示了慢性HBV感染自然進(jìn)展過程中患者血清中的蛋白質(zhì)變化，以期找到相關(guān)的生物標(biāo)志物。吉凱基因提供了TMT蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)。
考慮到丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、HBV DNA水平和肝臟炎癥出現(xiàn)的情況，慢性HBV感染的自然史（自然進(jìn)程）可大致分為四個階段：
1. 免疫耐受（IT）或HBeAg陽性慢性感染；
2. 免疫反應(yīng)性HBeAg陽性（IA）或HBeAg陽性慢性肝炎；
3. 非活躍HBV攜帶狀態(tài)（IC）或HBeAg陰性慢性感染；
4. HBeAg陰性慢性肝炎（ENH）。
其中，IA和ENH患者應(yīng)該進(jìn)行抗病毒治療，而IT患者則不宜進(jìn)行抗病毒治療。但部分IT患者表現(xiàn)出和IA類似的特征，這一部分也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的治療干預(yù)，以防止更嚴(yán)重的疾病進(jìn)展。但在當(dāng)前的臨床實(shí)際中，有一些不確定的情況，使得醫(yī)生很難判定是否進(jìn)行相關(guān)干預(yù)治療。本研究旨在尋找慢性HBV感染不同階段的血液蛋白標(biāo)志物，為臨床干預(yù)治療提供科學(xué)依據(jù)。
血清蛋白質(zhì)組學(xué)分組策略
收集以上四類疾病階段的病人血清樣本，每10人的樣本混合為1個樣本。收集齊樣本后（IT：2；IA：4；IC：2；ENH：2）先進(jìn)行去高豐度蛋白，隨后進(jìn)行TMT蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。
研究結(jié)果
1. 慢性HBV感染自然進(jìn)程中的差異蛋白
血清TMT蛋白質(zhì)組學(xué)（去除高豐度蛋白）共檢測到了1162個蛋白。沿著慢性HBV感染進(jìn)程，共篩選得到116個差異蛋白（DEP）。GO富集分析顯示，這些DEP富集在免疫學(xué)過程包括白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫響應(yīng)和免疫效應(yīng)過程。Reactome pathway分析顯示，DEP主要映射到固有免疫系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。這些結(jié)果表明，慢性HBV感染不同階段的蛋白表達(dá)變化主要聚焦在免疫病理過程。對226個DEP進(jìn)行STEM趨勢分析，共顯示有20個表達(dá)趨勢簇。其中，只有3個趨勢簇具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，包括簇15：反映ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）的表達(dá)；簇17：IT階段最低表達(dá)以及簇18：ENH階段最高表達(dá)。
2. 慢性肝炎和慢性HBV感染間的差異蛋白分析
研究者分析了慢性肝炎（IA+ENH）與慢性感染（IT+IC）之間的差異蛋白。熱圖顯示了這兩種狀態(tài)下血清蛋白質(zhì)特征的特異性。火山圖展示了兩組間的136個差異蛋白，包括130個上調(diào)蛋白和6個下調(diào)蛋白。和預(yù)期一致，很多酶在慢性肝炎組中高表達(dá)，包括ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和AST（天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）。Wiki Pathway分析顯示，136個蛋白主要聚集在蛋白酶體降解、糖酵解/糖異生和氨基酸代謝途徑。GSEA分析的結(jié)果和上述結(jié)果高度一致。尤其是，聚類分析顯示屬于蛋白酶體途徑的兩個蛋白酶體激活亞基1（PSME1）和蛋白酶體亞基α7（PSMA7）顯示了最高表達(dá)。因此，研究者用ELISA檢測了血清中的PSME1和PSMA7，結(jié)果和蛋白組學(xué)的結(jié)果一致，相比于慢性感染組，PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表達(dá)。總體，這些結(jié)果表明蛋白酶體通路是最顯著上調(diào)的通路，而PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表達(dá)。
3.IA（免疫反應(yīng)性HBeAg陽性）和IT（免疫耐受）之間的差異蛋白分析
IA（免疫反應(yīng)性HBeAg陽性）和IT（免疫耐受）的患者有高水平的HBV DNA，但是ALT水平則波動較大。為了進(jìn)一步研究蛋白變化，研究者比較了IA組和IT組的蛋白表達(dá)法。火山圖展示了兩組間的119個差異蛋白，包括105個上調(diào)蛋白和14個下調(diào)蛋白。特別地，CD163是上調(diào)最顯著的蛋白。CD163在IA組中的高表達(dá)也得到了ELISA實(shí)驗的驗證。總體上，慢性HBV感染的患者血清與健康人相比有更高的CD163水平。KEGG和GSEA分析表明，蛋白酶體途徑是最顯著上調(diào)的通路。研究者用ELISA檢測了血清中蛋白酶體途徑相關(guān)蛋白，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，與IT患者相比，IA患者表達(dá)高水平的PSME1、PSMA7、PSMA6和PSMB10。慢性HBV感染的不同階段比健康人高表達(dá)PSMA6。總體，這些結(jié)果表明，相比于IT階段的患者，IA階段的患者高表達(dá)CD163和多種蛋白酶體相關(guān)蛋白。
4. IT（免疫耐受）和非活躍HBV攜帶狀態(tài)（IC）之間的差異蛋白分析
IT和IC階段沒有或只有很小程度的炎癥壞死或纖維化，但它們具有不同的病毒載量。火山圖展示了IT組和IC之間的50個差異蛋白。這50個差異蛋白的KEGG分析顯示主要富集在糖酵解/糖異生途徑。特別地，聚類圖顯示EEF2（elongation factor 2）是最顯著上調(diào)的蛋白，而MOYC和EFNB2是最顯著下調(diào)的蛋白。由于缺少EEF2的ELISA試劑盒，作者檢測了熱反應(yīng)蛋白12（HRSP12）的水平，該蛋白在IT階段也顯著增加。在慢性HBV感染的不同階段，皮爾森相關(guān)性分析顯示EFNB2水平與HBeAg、HBV DNA和HBsAg水平呈負(fù)相關(guān)。HRSP12與HBeAg、HBV DNA和HBsAg呈正相關(guān)。
5. ENH（HBeAg陰性，慢性感染）和IC（非活躍HBV攜帶狀態(tài)）之間的差異蛋白分析
ENH和IC階段的特征是HBeAg陰性。研究者進(jìn)一步比較了ENH和IC之間的蛋白質(zhì)差異。火山圖展示了兩組間的55個差異蛋白，包括43個上調(diào)蛋白和12個下調(diào)蛋白。特別地，聚類圖顯示SOD2是最顯著上調(diào)的蛋白。GSEA分析顯示，ENH組只有糖酵解/糖異生途徑是上調(diào)的。Wiki Pathway和KEGG分析顯示，這55個蛋白主要富集在糖酵解/糖異生途徑，包括FBP1和ENO1。STEM分析得到的簇18含有12種蛋白質(zhì)，包括白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白（IL-18BP），其在慢性HBV感染的不同階段顯示出最顯著的不同。接下來，研究者使用ELISA做了進(jìn)一步驗證。與IC患者相比，ENH患者表達(dá)高水平的SOD2、IL-18BP和ENO1。盡管FBP1在ENH患者和IC患者之間沒有顯著差異，但在HBeAg陽性患者中有比HBeAg陰性患者和健康對照更高的FBP1。
本文，研究者對慢性HBV感染自然進(jìn)程的患者血清進(jìn)行了TMT蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。隨后，通過生物信息學(xué)分析篩選出差異蛋白（DEP）。最后，研究者通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）評估臨床樣本，驗證了慢性HBV感染進(jìn)程中的DEP。作者的結(jié)果提供了區(qū)分感染HBV不同階段的潛在生物標(biāo)志物，有助于開發(fā)新型生物標(biāo)志物和治療慢性HBV感染的靶標(biāo)。
吉凱助力
本研究的TMT血清蛋白質(zhì)組學(xué)由吉凱基因提供技術(shù)服務(wù)。
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規(guī)測序服務(wù)和單細(xì)胞測序服務(wù)：單細(xì)胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測序等服務(wù)；常規(guī)測序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)