當(dāng)我們?nèi)コ匈徫锏臅r候，通過掃描商品的條形碼就可以實現(xiàn)自助購物，每一件商品的條形碼都顯示了它的價格。那么我們能不能通過給細(xì)胞打上條形碼從而實現(xiàn)對細(xì)胞的追蹤呢？通過我們新上的條形碼慢病毒文庫就可以實現(xiàn)這樣子的功能啦。那么什么是條形碼文庫，它的基本原理是什么呢?以及為什么它被稱為細(xì)胞譜系示蹤文庫呢？它的使用范圍是哪些呢？今天的這一篇推文我們根據(jù)Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation[1]一文一起來學(xué)習(xí)一下。
首先，我們要知道什么叫做條形碼文庫。條形碼文庫指的是使用 DNA 條形碼克隆標(biāo)記細(xì)胞。通過單細(xì)胞測序讀取這些條形碼，可以從分化的細(xì)胞群中重建全基因組轉(zhuǎn)錄軌跡。每個條形碼是一個 40-mer，由 28 個隨機(jī)和 11 個恒定核苷酸堿基組成。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染將可遺傳的DNA條形碼插入到基因組中，通過測序可檢測到DNA條形碼。它的結(jié)構(gòu)圖見圖1。
圖1：可遺傳的條形碼病毒的結(jié)構(gòu)
對于條形碼文庫的多樣性，理論上有428種，但是實際上多樣性要低得多，每個條形碼要經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并從細(xì)菌菌落中收獲才能出現(xiàn)在最終文庫中。根據(jù)文中所說的體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)庫中抽取了10000個條形碼，并確認(rèn)這些樣本中有多少條形碼是共享的，以此來估算文庫總體的多樣性。T是文庫中唯一條形碼的總數(shù)，當(dāng)T>>10000時，共享條形碼的N值可以根據(jù)下列公式計算。
根據(jù)實際的10000個取樣中，有N=241±13個條形碼，根據(jù)公式算出來T=414811±22194，即5×105。根據(jù)公式得出了條形碼多樣性的下限。
對于它的應(yīng)用場景，利用條形碼文庫病毒結(jié)合單細(xì)胞測序可以在連續(xù)的細(xì)胞狀態(tài)圖譜上繪制細(xì)胞譜系示蹤。通過條形碼文庫病毒標(biāo)記細(xì)胞然后立即或者在分化之后取樣，這樣就可以將細(xì)胞的初始狀態(tài)和它們的分化結(jié)果聯(lián)系起來。下圖是這兩個步驟的示意圖：
圖2：細(xì)胞譜系示蹤
在文章中作者做了體外、體內(nèi)移植造血干細(xì)胞的相關(guān)實驗。在體外的研究中，條形碼病毒一般作用于體外分離的造血干細(xì)胞。在條形碼病毒感染之后，將細(xì)胞培養(yǎng)兩天，以便慢病毒的整合和分裂。對一半的的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，另一半的細(xì)胞在兩天后和四天后進(jìn)行單細(xì)胞測序取樣（圖c）。從培養(yǎng)液中提取了130887個細(xì)胞用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，有38%的細(xì)胞屬于由兩個或者更多的細(xì)胞組成的克隆，由1816個細(xì)胞呈現(xiàn)跨越早期和晚期的狀態(tài)。利用SPRING對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了可視化。在體外，體現(xiàn)了細(xì)胞從多能祖細(xì)胞（MPPs）到九種成熟細(xì)胞狀態(tài)的連續(xù)的狀態(tài)圖。在這種情況下，克隆表現(xiàn)出一系列行為，以及早期祖細(xì)胞的自我更新。
圖3：體外感染造血干細(xì)胞的譜系示蹤
對于標(biāo)記了條形碼病毒的造血干細(xì)胞的譜系示蹤上，文獻(xiàn)中將其移植到小鼠體內(nèi)。并且在移植之后提取了182173個單細(xì)胞用于單細(xì)胞測序，有63%的細(xì)胞屬于由兩個或更多的細(xì)胞組成的克隆，由817個細(xì)胞呈現(xiàn)跨越跨越早期和晚期的狀態(tài)。對于移植到體內(nèi)的細(xì)胞的譜系示蹤，跨度從MPPs到中性粒細(xì)胞成熟的幾個階段。
圖4：體內(nèi)移植條形碼標(biāo)記的造血干細(xì)胞的譜系示蹤
從這篇文獻(xiàn)我們了解了條形碼文庫病毒的基本原理以及相關(guān)的運用方向，我們可以看到結(jié)合條形碼文庫病毒進(jìn)一步是利用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）追蹤標(biāo)記了條形碼的單個細(xì)胞的克隆譜系的分化狀態(tài)。感興趣的老師們快來咨詢我們吧。
參考文獻(xiàn):
[1] Weinreb, C., et al., Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during
differentiation. Science, 2020. 367(6479).