目前Monocle是scRNA-seq擬時(shí)序分析的經(jīng)典工具，使用最廣泛的是Monocle2。Monocle2 通過反向圖嵌入(Reversed Graph Embedding) 技巧學(xué)習(xí)細(xì)胞軌跡的主要結(jié)構(gòu)，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序，能較為準(zhǔn)確地解釋復(fù)雜的生物學(xué)過程。

接下來，讓我們一起來看看運(yùn)用monocle2的擬時(shí)序分析在文獻(xiàn)中的運(yùn)用吧！

案例分析

案例一

研究概況
胰腺導(dǎo)管癌（PDAC）是最常見的胰腺癌，具有高度腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和不良預(yù)后特征。為了全面描述PDAC的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和PDAC進(jìn)展的潛在機(jī)制，協(xié)和醫(yī)院的研究人員采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)獲得了來自原發(fā)性PDAC腫瘤和對(duì)照組胰腺的57,530個(gè)胰腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并確定了不同的惡性細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類型，包括分別具有異常和惡性的基因表達(dá)譜的兩種導(dǎo)管亞型。作者發(fā)現(xiàn)異質(zhì)的惡性亞型由幾個(gè)具有不同的增殖和遷移潛力的亞群組成。

樣本信息
實(shí)驗(yàn)組：24個(gè)PDAC腫瘤樣本（41,986個(gè)細(xì)胞）
對(duì)照組：11個(gè)未經(jīng)處理的胰腺樣本（15,544個(gè)細(xì)胞）

研究過程及結(jié)果（著重解讀擬時(shí)序分析）
為了探索腫瘤的細(xì)胞組成，作者進(jìn)行了分群并在t-SNE降維結(jié)果上進(jìn)行展示，確定了10個(gè)主要細(xì)胞群，包括1型導(dǎo)管細(xì)胞（type 1 ductal），2型導(dǎo)管細(xì)胞（type 2 ductal），腺泡細(xì)胞（acinar），內(nèi)分泌細(xì)胞（endocrine），內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial），成纖維細(xì)胞（fibroblast），星狀細(xì)胞（stellate），巨噬細(xì)胞（macrophage），T細(xì)胞和B細(xì)胞 （T and B cells）（圖1a）

作者接下來檢測(cè)了兩種導(dǎo)管細(xì)胞的基因表達(dá)模式，MUC1標(biāo)志物可以用來區(qū)分具有異常基因表達(dá)譜的1型導(dǎo)管細(xì)胞和惡化程度較高的2型導(dǎo)管細(xì)胞，其中1型導(dǎo)管細(xì)胞分為兩個(gè)不同的亞組 (圖1b)，第一個(gè)亞組顯示出較低的MUC1表達(dá)，第二個(gè)亞組顯示出較高的MUC1表達(dá)（表現(xiàn)出一些2型惡性導(dǎo)管細(xì)胞的特征）（圖1c）。

圖1.細(xì)胞分群

(a) t-SNE圖揭示PDAC中的主要細(xì)胞類型
(b) t-SNE展示1型導(dǎo)管細(xì)胞的2個(gè)亞組
(c) 小提琴圖展示正常導(dǎo)管細(xì)胞的標(biāo)記物（AMBP）和腫瘤導(dǎo)管細(xì)胞的標(biāo)記物（MUC1）在兩個(gè)亞組中的表達(dá)水平

作者對(duì)基因表達(dá)圖譜異常的1型導(dǎo)管細(xì)胞和惡性化程度較高的2型導(dǎo)管細(xì)胞進(jìn)行了擬時(shí)序分析。圖2a揭示了低表達(dá)MUC1的1型導(dǎo)管細(xì)胞經(jīng)過高表達(dá)MUC1的1型導(dǎo)管細(xì)胞的過渡發(fā)展為惡性化程度較高的2型導(dǎo)管細(xì)胞。沿著PDAC進(jìn)展的軌跡，作者進(jìn)一步分析了所有基因的表達(dá)模式。作者將這些基因聚類為4個(gè)異常表達(dá)模式和4個(gè)惡性模式。大部分負(fù)責(zé)細(xì)胞增殖和遷移的基因在腫瘤進(jìn)展的晚期被明顯激活（圖2b）。作者同樣檢測(cè)到了多個(gè)參與PDACs腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子的激活，包括幾個(gè)可能與PDAC進(jìn)展相關(guān)的基因，如PI3K-Akt通路激活劑YWHAZ（圖2c）。也就是說，細(xì)胞軌跡的分析揭示了多種腫瘤相關(guān)的通路和轉(zhuǎn)錄因子在PDAC的進(jìn)展過程中差異性地表達(dá)

圖2.惡性腫瘤發(fā)展過程中的差異基因表達(dá)譜

(a) 由Monocle2推斷的有異常基因表達(dá)譜的導(dǎo)管細(xì)胞和惡性導(dǎo)管細(xì)胞的偽時(shí)間。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)細(xì)胞。不同顏色代表不同細(xì)胞類型；
(b) 隨著偽時(shí)間差異表達(dá)的基因被分層聚類為八個(gè)模式，每個(gè)剖面的代表性基因功能和通路如圖所示；
(c) 熱圖展示了參與PDAC進(jìn)展的代表性基因的表達(dá)。從藍(lán)色到紅色表示從低到高的相對(duì)表達(dá)水平；
(d) 熱圖展示了編碼參與PDACs腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子的基因的表達(dá)。從藍(lán)色到紅色表示從低到高的相對(duì)表達(dá)水平。

案例二

研究概況
為了研究免疫細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨骼穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，華西醫(yī)院的研究人員對(duì)小鼠下顎牙槽骨樣本進(jìn)行了scRNA-seq，揭示了巨噬細(xì)胞是與顱面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）相互作用的最大細(xì)胞群。與長(zhǎng)骨骨髓（LBM）相比，活化的巨噬細(xì)胞亞群在肺泡骨髓（ABM）中的比例更高，并且這個(gè)亞群是分泌細(xì)胞因子Oncostatin M（Osm）的主要群體。ABM巨噬細(xì)胞調(diào)理的培養(yǎng)基能通過依賴細(xì)胞因子Osm的通路更有效地促進(jìn)成骨分化和抑制MSCs的成脂分化。

樣本信息
8只12周大的雄性C57BL/6J野生型小鼠下顎牙槽骨樣本

研究過程及結(jié)果 （著重解讀擬時(shí)序分析）
通過單細(xì)胞測(cè)序獲得了總共10224個(gè)細(xì)胞。根據(jù)典型的細(xì)胞表面標(biāo)記，作者確定了12個(gè)細(xì)胞群，包括中性粒細(xì)胞（neutrophil），髓系祖細(xì)胞（myeloid progenitor），巨噬細(xì)胞（macrophage），樹突狀細(xì)胞（dendritic cell）, B細(xì)胞（B cell），原B細(xì)胞（pro-B cell），T細(xì)胞（T cell）, 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell），巨核細(xì)胞（megakaryocyte），紅細(xì)胞（erythrocyte），造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell/HSPC），間質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal cell）（圖3）。

圖3.用UMAP對(duì)scRNA-seq鑒定的細(xì)胞進(jìn)行的可視化。不同的細(xì)胞群被定義并以顏色區(qū)分。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞。

接下來，作者用CellPhoneDB2進(jìn)行了細(xì)胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之間存在著密切的互動(dòng)。通過進(jìn)一步探索巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，巨噬細(xì)胞群被分為四個(gè)亞群 （圖4a）。其中亞群0和1普遍的標(biāo)志物基因有Csf1r, Cd68和 Cd14。亞群1高表達(dá)極化巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物基因，如Stat1, Il1b和 Ccr2。亞群2高表達(dá)交替活化巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物基因Adgre1, Mrc1 and Cd209f（圖4b）。通過GO富集分析，發(fā)現(xiàn)亞群3的生物功能富集在細(xì)胞分裂，DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的通路，是巨噬細(xì)胞主要的增殖群體。亞群0，1，2是具有不同功能的成熟的巨噬細(xì)胞群體。亞群0富集于吞噬功能和抗原呈現(xiàn)，亞群1與細(xì)胞因子的分泌，細(xì)菌和細(xì)胞內(nèi)病原體的免疫反應(yīng)有關(guān)，亞群2表現(xiàn)交替活化巨噬細(xì)胞的特征如傷口愈合和血管形成的調(diào)節(jié)（圖4c）。

圖4.巨噬細(xì)胞亞分群情況

（a）巨噬細(xì)胞的四個(gè)亞群可視化
（b）巨噬細(xì)胞群中經(jīng)典巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的表達(dá)情況
（c）巨噬細(xì)胞不同亞群的生物功能GO富集分析

接下來，作者進(jìn)行了擬時(shí)序分析。基于巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)，作者構(gòu)建了一棵偽時(shí)間發(fā)育樹，并確定了兩個(gè)獨(dú)立的分支點(diǎn) （圖5a）。這4個(gè)巨噬細(xì)胞亞群散布在發(fā)育樹的不同分支處。亞群3位于發(fā)育樹的起點(diǎn)，表明是其他亞群的發(fā)育起源。這一觀察結(jié)果與之前GO富集的結(jié)果（亞群3作為一個(gè)增殖群體）一致。亞群0和1位于兩個(gè)不同的分支，亞群2分布更為廣泛，部分與亞群0和1重疊（圖5b）。隨偽時(shí)間分布的基因表達(dá)模式表明Cd68和Csf1r（普遍的標(biāo)志物基因）的表達(dá)曲線相對(duì)平穩(wěn)。伴隨著Cd68和Csf1r （亞群0和1的maker gene）表達(dá)量的減少，Apoe和Adgre1 （亞群2的marker gene）表達(dá)量增加。Mki67和Pcna的表達(dá)只在亞群3中上調(diào)（圖5c）。如圖5d所示，在兩個(gè)分支中具有最顯著變化的且表達(dá)模式相似的基因被聚到了一類。

圖5.巨噬細(xì)胞群的擬時(shí)序分析

(a) 按偽時(shí)間值排列的巨噬細(xì)胞群的軌跡順序。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)細(xì)胞，顏色越深表示偽時(shí)間值（離根節(jié)點(diǎn)的距離）越小；
(b) 巨噬細(xì)胞亞群在發(fā)育樹上的集群分布。不同顏色代表不同細(xì)胞亞群；
(c) 巨噬細(xì)胞不同亞群的標(biāo)志物基因隨偽時(shí)間的表達(dá)；
(d) 兩個(gè)軌跡分支點(diǎn)上的差異基因的聚類熱圖。（橫坐標(biāo)為偽時(shí)間，中間的白色豎條代表時(shí)間最早的細(xì)胞，豎條左右兩邊分別代表兩個(gè)Lineage上的時(shí)間點(diǎn)，熱圖的最左邊和最右邊分別代表這兩個(gè)Lineage上時(shí)間最晚的細(xì)胞，上方紅色、灰色、藍(lán)色的色條分別表示第一條 Lineage 特有的時(shí)間部分，兩條 Lineage 共有的時(shí)間部分，即兩條Lineage共同的祖先細(xì)胞，第二條Lineage特有的時(shí)間部分。縱坐標(biāo)為基因，熱圖中的每一格表示該基因在該偽時(shí)間點(diǎn)的平均表達(dá)量scale后的值，顏色越藍(lán)，表達(dá)量越低，顏色越紅，表達(dá)量越高，左邊的樹為基因的層次聚類樹，不同色條表示該基因在層次聚類方法的劃分下所屬的 cluster）。

結(jié) 語

通過以上兩個(gè)案例，我們可以發(fā)現(xiàn)擬時(shí)序分析可以幫助了解細(xì)胞發(fā)育的軌跡以及過渡細(xì)胞類型，也可以展示在發(fā)育或分化節(jié)點(diǎn)起關(guān)鍵作用的核心基因在細(xì)胞進(jìn)展過程中的表達(dá)情況，這些都為后續(xù)的分析奠定了一定的基礎(chǔ)。希望這次分享的運(yùn)用monocle2進(jìn)行擬時(shí)序分析的文獻(xiàn)能為老師們提供一些啟發(fā)。

【參考文獻(xiàn)】
1.Peng, J., Sun, B. F., Chen, C. Y., Zhou, J. Y., Chen, Y. S., Chen, H., Liu, L., Huang, D., Jiang, J., Cui, G. S., Yang, Y., Wang, W., Guo, D., Dai, M., Guo, J., Zhang, T., Liao, Q., Liu, Y., Zhao, Y. L., Han, D. L., … Wu, W. (2019). Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell research, 29(9), 725–738. https://doi.org/10.1038/s41422-019-0195-y
2.Lin, W., Li, Q., Zhang, D., Zhang, X., Qi, X., Wang, Q., Chen, Y., Liu, C., Li, H., Zhang, S., Wang, Y., Shao, B., Zhang, L., & Yuan, Q. (2021). Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolution. Bone research, 9(1), 17. https://doi.org/10.1038/s41413-021-00141-5