Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種屬同源性并對應不同的反應底物，故而沒有交叉干擾。以Luciferase為核心，構(gòu)建研究對象到相應位置，轉(zhuǎn)染細胞，裂解細胞，分別加熒光素酶底物，用熒光測定儀檢測熒光強度，通過數(shù)據(jù)得出基因表達量，從而確定構(gòu)建序列的功能。雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗提供一基準線，從而可以減小細胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。
雙熒光素酶實驗往往不會單獨出現(xiàn)在文章中，而是在驗證結(jié)合位點時，作為點睛之筆，拔高整片文章的上限。本文結(jié)合吉凱基因的客戶文獻，與老師們一同回顧下雙熒光素酶實驗的兩大經(jīng)典應用。
一、轉(zhuǎn)錄因子-啟動子預測[2]：
啟動子能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性；轉(zhuǎn)錄因子（TFs）調(diào)節(jié)基因表達，保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。將啟動子區(qū)域序列插入到報告基因載體（常用載體為pGL3-Basic Vector，將待檢測的啟動子序列構(gòu)建在報告基因上游），同時在細胞實驗中共表達轉(zhuǎn)錄因子，分析熒光素酶表達水平，反應轉(zhuǎn)錄因子是否影響基因表達情況。
本片文獻中介紹道：葡萄糖刺激胰島素分泌受損(GSIS)是2型糖尿病的一個標志。胰島B細胞KLB基因的敲除，導致GSIS缺陷和葡萄糖耐受不良，而AAV介導KLB基因的修復，可緩解2型糖尿病小鼠胰島GSIS缺陷。在接下來的機制驗證環(huán)節(jié)，作者鎖定了KLB-STAT3-HIFα通路，那么轉(zhuǎn)錄因子STAT3具體結(jié)合上HIFα啟動子上哪段序列來發(fā)揮作用呢？
為了驗證這一猜想（Fig e-f）：作者在網(wǎng)站中，預測了STAT3在HIFα啟動子上的兩處結(jié)合位點（WT型），并且構(gòu)建了3個突變質(zhì)粒，分別為僅突變位點1的Mut-1、僅突變位點2的Mut-2，與同時突變位點1 + 位點2的Mut-1&2。雙熒光素酶結(jié)果顯示：Mut-1與Mut-2的相對熒光值均下降，但Mut-1&2的相對熒光值下降幅度最大，說明預測的兩處結(jié)合位點均為STAT3在HIFα啟動子上的有效靶點。如果老師們不太了解轉(zhuǎn)錄因子-啟動子的操作方法，可以點擊下方鏈接（https://mp.weixin.qq.com/s/CMwNob4kI8d7rBPlQEaKWA），觀看我們吉凱病毒構(gòu)建組的陳博錄制的操作視頻，聰明的小伙伴肯定一學就會。
二、miRNA-靶基因結(jié)合[3]：
3‘UTR是位于編碼基因終止密碼子下游延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端，通過自身結(jié)構(gòu)或者與其他分子相互作用調(diào)控基因表達，miRNA大部分通過成熟體種子區(qū)與3’UTR結(jié)合抑制蛋白翻譯。將待驗證序列插入到報告基因載體的3‘UTR區(qū)域，再共轉(zhuǎn)入microRNA，如果熒光素酶表達下降，則待驗證序列是miRNA靶序列。
本文探索了miRNA-22-3p在阿爾茲海默病（AD）中的功能和作用機制。體外實驗中，過表達miRNA-22-3p可顯著改善小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞的凋亡；體內(nèi)實驗過表達miRNA-22-3p，可改善阿爾茲海默病模型小鼠的認知功能、減輕β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積。在蛋白組學分析，鎖定了差異蛋白SOX9，進一步通過GO和KEGG分析，挑選了NF-κB信號通路。那么miRNA-22-3p是結(jié)合上了SOX9的哪段序列，來發(fā)揮抑制作用的呢？
首先作者通過網(wǎng)站預測出miRNA-22-3p在SOX9中的結(jié)合位點，結(jié)果顯示：miR-22-3p和Sox9的最低自由能為?21.0 kcal/mol，22個堿基中有17個位點相結(jié)合（Fig A）。雙熒光素酶實驗進一步證實了miR- 22-3p與Sox9的結(jié)合關(guān)系。結(jié)果顯示，向野生Sox9組添加miR-22-3p會導致熒光顯著降低，但在突變Sox9組中沒有降低（Fig B）。
三、Lentivirus-CMV-Luciferase活體成像[4]
四、分析信號通路是否激活[5]
將該信號通路的下游響應原件序列構(gòu)建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下游響應。比如說，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體（pGL4質(zhì)粒圖譜）構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，可以用于低氧相關(guān)通路的研究。
作者的實驗流程圖如Fig A，F(xiàn)ig B-K：通過低氧產(chǎn)生的酸性環(huán)境，來調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH；加入HIFα的siRNA或LDH抑制劑，觀察下游通路的響應程度，而觀察的方法就是通過算出雙熒光素酶熒光強度的比值，來統(tǒng)計結(jié)果的。
最后，做轉(zhuǎn)錄因子-啟動子預測實驗，我為老師推薦GV238載體（下圖左），默認取基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2K序列構(gòu)建報告系統(tǒng)；做miRNA-靶基因結(jié)合實驗，我為老師推薦GV272載體（下圖中），靶基因選擇為miRNA結(jié)合位點兩端各延伸100bp，構(gòu)建報告系統(tǒng)。隨著研究的深入，如果pGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工具細胞（293T細胞）無法滿足實驗需求，例如老師想要在目的細胞（血液細胞）中，表達熒光素酶，這是推薦老師選用慢病毒（下圖右）作為載體GV715[6]。
結(jié)語
工欲善其事，必先利其器。吉凱基因作為提供病毒載體包裝服務(wù)，與科研服務(wù)的企業(yè)，已經(jīng)走過了21年的歷程。
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參考文獻
1. Liu Y, Wang J, Shou Y, Xu W, Huang Z, Xu J, Chen K, Liu J, Liu D, Liang H, Yang H, Zhang X. Restoring the epigenetically silenced lncRNA COL18A1-AS1 represses ccRCC progression by lipid browning via miR-1286/KLF12 axis. Cell Death Dis. 2022 Jul 4;13(7):578. doi: 10.1038/s41419-022-04996-2. PMID: 35787628; PMCID: PMC9253045.
2. Geng L, Liao B, Jin L, Yu J, Zhao X, Zhao Y, Zhong L, Wang B, Li J, Liu J, Yang JK, Jia W, Lian Q, Xu A. β-Klotho promotes glycolysis and glucose-stimulated insulin secretion via GP130. Nat Metab. 2022 May;4(5):608-626. doi: 10.1038/s42255-022-00572-2. Epub 2022 May 12. PMID: 35551509.
3. Xia P, Chen J, Liu Y, Cui X, Wang C, Zong S, Wang L, Lu Z. MicroRNA-22-3p ameliorates Alzheimer's disease by targeting SOX9 through the NF-κB signaling pathway in the hippocampus. J Neuroinflammation. 2022 Jul 12;19(1):180. doi: 10.1186/s12974-022-02548-1. PMID: 35821145; PMCID: PMC9277852.
4. Zhu Z, Cao C, Zhang D, Zhang Z, Liu L, Wu D, Sun J. UBE2T-mediated Akt ubiquitination and Akt/β-catenin activation promotes hepatocellular carcinoma development by increasing pyrimidine metabolism. Cell Death Dis. 2022 Feb 15;13(2):154. doi: 10.1038/s41419-022-04596-0. PMID: 35169125; PMCID: PMC8847552.
5. Walton ZE, Patel CH, Brooks RC, Yu Y, Ibrahim-Hashim A, Riddle M, Porcu A, Jiang T, Ecker BL, Tameire F, Koumenis C, Weeraratna AT, Welsh DK, Gillies R, Alwine JC, Zhang L, Powell JD, Dang CV. Acid Suspends the Circadian Clock in Hypoxia through Inhibition of mTOR. Cell. 2018 Jun 28;174(1):72-87.e32. doi: 10.1016/j.cell.2018.05.009. Epub 2018 May 31. PMID: 29861175; PMCID: PMC6398937.
6. 李晨, 張斌, 王軍,等. 慢病毒表達雙報告基因載體系統(tǒng)的構(gòu)建及病毒制備[J]. 中國實驗血液學雜志, 2011, 19(6):4.