自噬是近年來國(guó)自然的研究熱點(diǎn)之一，那么自噬究竟是什么，怎么研究？跟小編一起一探究竟吧！
什么是自噬？
自噬 (autophagy)，是細(xì)胞中存在的一種非常關(guān)鍵的實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器的更新的機(jī)制。在饑餓、能量缺乏等代謝應(yīng)激條件下，細(xì)胞為了自救，會(huì)通過自噬來獲得新的能量來源和物質(zhì)需求以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。
自噬的分類
根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，自噬分為以下幾種。
01 大自噬（macroautophagy）
由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或細(xì)胞質(zhì)膜等來源的膜，包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體（autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物；
02 微自噬（microautophagy）
溶酶體的膜直接包裹待降解物，并在溶酶體內(nèi)降解；
03 分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone mediated autophagy, CMA）
胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中，然后被溶酶體酶消化。
CMA 的底物是可溶的蛋白質(zhì)分子，在清除蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。
自噬研究?jī)r(jià)值？
自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到，自噬還參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)展的早期，自噬通過減少細(xì)胞內(nèi)的過氧化物來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制腫瘤形成。如果自噬功能降低或紊亂，會(huì)引發(fā)一系列的疾病；大量研究表明，自噬功能障礙與衰老、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管病、代謝糖尿病和自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分。
因此自噬在疾病治療方面有很大的應(yīng)用前景，可以通過控制自噬過程，來有效清除有害或受損物質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡來治療疾病。
自噬該如何研究呢？
LC3全稱MAP1LC3 ，貫穿整個(gè)自噬過程，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生胞漿定位的LC3-I。
在自噬過程中，LC3-I會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯(lián)，形成LC3-II并定位于自噬體內(nèi)外膜上。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產(chǎn)生LC3-I循環(huán)利用；內(nèi)膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導(dǎo)致自噬溶酶體中LC3含量很低。因此，可以通過熒光顯微鏡觀察mRFP-GFP-LC3或GFP-LC3，實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬發(fā)生的檢測(cè)。
自噬的檢測(cè)方法及原理：
1、LC3雙熒光標(biāo)記法
mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系的出現(xiàn)，將自噬研究帶入了一個(gè)新的階段，自噬不再只是指標(biāo)，而是一種機(jī)制，自噬流的順暢與否，對(duì)于細(xì)胞生理功能的穩(wěn)定非常關(guān)鍵。
觀察自噬流變化的LC3雙熒光標(biāo)記法，即使用同時(shí)帶有RFP和GFP的病毒感染細(xì)胞。GFP是酸敏感型GFP蛋白，在酸性環(huán)境下GFP會(huì)淬滅，而mRFP是穩(wěn)定的熒光表達(dá)基團(tuán)，不受外界影響。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，可見明亮黃光點(diǎn)，此為被紅光和綠光同時(shí)標(biāo)記的自噬體；當(dāng)自噬體和溶酶體融合，自噬溶酶體內(nèi)的pH值降低，使得改造過的GFP蛋白熒光淬滅，只可觀測(cè)到紅光。
因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程受阻。mRFP是一直穩(wěn)定表達(dá)的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點(diǎn)比例來評(píng)價(jià)自噬流進(jìn)程。
吉?jiǎng)P設(shè)計(jì)的LC3雙熒光自噬系統(tǒng)采用綠色熒光蛋白Sens-GFP和紅色熒光蛋白Stub-RFP，這兩種熒光具有更高的熒光強(qiáng)度，綠色熒光標(biāo)記Sens-GFP對(duì)pH值更為敏感，在自噬溶酶體中淬滅更完全；而且Sens-GFP和Stub-RFP具有更低的細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響更小。
2、GFP-LC3 單熒光自噬指示體系
利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的原理，開發(fā)出GFP-LC3指示技術(shù)：無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。但是綠色斑點(diǎn)增多并不一定代表自噬活性增強(qiáng)，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測(cè)游離的GFP、p62來驗(yàn)證。
3、Western Blot檢測(cè)LC3的切割
利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3會(huì)酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。
4、透射電鏡下觀察自噬體的形成
自噬經(jīng)歷了三個(gè)階段：吞噬泡(phagophore)--自噬小體(autophagosome)--自噬溶酶體(autolysosome)。
透射電鏡下吞噬泡(phagophore)的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬小體(autophagosome)的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(autolysosome)的特征為：?jiǎn)螌幽ぃ麧{成分已降解。
5、WB檢測(cè)自噬底物p62
在自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進(jìn)自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解，所以p62蛋白的表達(dá)量與自噬活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。因此，利用Western Blot檢測(cè)p62蛋白的表達(dá)量也可以評(píng)價(jià)自噬水平。
自噬的人工干預(yù)和調(diào)節(jié)
正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察。
為了研究自噬，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)
（一）自噬誘導(dǎo)劑
1）Brefeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3）Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
5）Rapamycin：最典型最常用的自噬激動(dòng)劑(最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
2）Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還可以結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)。
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