【答疑解惑】類器官培養(yǎng)100問-血管共培養(yǎng)篇

類器官是由成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化并經(jīng)體外3D環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)，具備主要組織或器官的三維結(jié)構(gòu)與生理功能。然而，大部分的類器官缺乏血管網(wǎng)絡(luò)的支持，這限制了其形態(tài)大小和發(fā)育狀態(tài)，導(dǎo)致無法完全模擬人體內(nèi)真實(shí)的組織器官。血管化問題是在類器官研究領(lǐng)域中的一個重要挑戰(zhàn)。

血管化類器官構(gòu)建的主要挑戰(zhàn)在于如何有效地形成和維持血管網(wǎng)絡(luò)，以確保類器官內(nèi)部細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物排出。血管化過程涉及復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制，包括血管發(fā)生和血管生成等，這些過程需要精確的調(diào)控和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。其中，類器官/血管共培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)類器官血管化的一種重要方法。為此，小編針對類器官/血管共培養(yǎng)體系的細(xì)胞來源、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、共培后類器官的功能鑒定及定位等常見問題進(jìn)行了匯總整理，歡迎感興趣的老師一起交流討論！

Q1：為了彌補(bǔ)單一類器官在應(yīng)用上的不足，目前我們可以選擇哪些共培養(yǎng)模型？

A1：

1、免疫微環(huán)境共培養(yǎng)（包括T、NK、CAF等免疫微環(huán)境中的各類細(xì)胞）；

2、血管共培養(yǎng)；

3、間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)；

4、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)共培養(yǎng)；

5、不同種類的類器官共培養(yǎng)；

6、作為感染模型共培養(yǎng)（如：病毒、細(xì)菌等共培養(yǎng)）。

Q2：當(dāng)我們需要做體外類器官血管化培養(yǎng)時，可以選用哪些來源的細(xì)胞作為類器官中“血管”的部分？

A2：

1、內(nèi)皮細(xì)胞。Takebe等人^【1】將iPSC衍生的肝內(nèi)胚層、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）接種在Matrigel中，培育出了血管化的肝芽（LBs）；

2、干細(xì)胞。如：iPSC、ESC可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管類器官；

3、類器官共分化。通過誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞同時向血管譜系和特定類器官譜系分化，以產(chǎn)生具有血管樣結(jié)構(gòu)的類器官^【2】。

Q3：類器官與血管共培養(yǎng)有哪些方面的應(yīng)用？

A3：

1、血管系統(tǒng)發(fā)揮著運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、代謝廢物等重要作用，在缺乏可灌注的血管系統(tǒng)模型中，類器官僅依靠被動擴(kuò)散來交換營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝廢物，如果尺寸過大，會逐漸導(dǎo)致類器官的核心壞死^【3】；

2、使用這些血管類器官來模擬疾病進(jìn)程中的血管病變。如：通過構(gòu)建干細(xì)胞誘導(dǎo)分化（iPSC）的血管類器官模型，可以用于阿爾茨海默病、心血管疾病、傷口愈合、中風(fēng)、癌癥和糖尿病等一系列血管相關(guān)疾病的病因和治療方法研究^【4】；

3、作為抑制血管生成藥物的效果評價模型。如：靶向血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體的藥物正在用于治療耐藥和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的研究^【5】；

4、作為特定的研究模型。如：血管類器官（BVOs）可以重現(xiàn)發(fā)育過程中血管的結(jié)構(gòu)和功能，并且BVOs浸潤腦類器官從而形成血腦屏障（BBB）模型^【6】。

Q4：類器官的血管共培養(yǎng)有哪些方式？

A4：

1、使用內(nèi)皮細(xì)胞包裹類器官共培養(yǎng)。如：將人內(nèi)皮細(xì)胞嵌入基質(zhì)膠中，并在其中添加早期類器官(如圖1）。隨著時間的流逝，這會導(dǎo)致人類內(nèi)皮細(xì)胞自組裝成類器官外圍的毛細(xì)血管并侵入形成血管網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然這種方式可以在類器官的外圍形成明顯的血管網(wǎng)絡(luò)，但在類器官中心的血管網(wǎng)絡(luò)形成較少^【7】；

圖1. 內(nèi)皮細(xì)胞包裹類器官共培養(yǎng)流程示意圖^【7】

2、干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞均勻混合后共培養(yǎng)。如：將hESCs或iPSCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)，定向誘導(dǎo)其分化為血管化的腦類器官（如圖2）。免疫熒光染色結(jié)果表明，HUVECs在腦類器官中相互連接，并形成具有通透能力的復(fù)雜血管系統(tǒng)，該血管系統(tǒng)可以在腦類器官中可穩(wěn)定存在200天以上^【8】；

圖2. 干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞均勻混合后共培養(yǎng)流程示意圖^【7】

3、誘導(dǎo)自發(fā)血管化。如：通過動態(tài)調(diào)節(jié)WNT信號通路，控制近端腎小球和遠(yuǎn)端腎小管的比例，調(diào)節(jié)近端足細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)的水平，進(jìn)而可誘導(dǎo)血管化的腎臟類器官分化形成^【9】；

4、移植到體內(nèi)形成血管結(jié)構(gòu)。如：在體外將人胚胎干細(xì)胞(hESC)誘導(dǎo)分化為腦類器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠軟腦膜血管上。移植的類器官繼續(xù)進(jìn)行分化和成熟，并與小鼠腦組織進(jìn)行了很好的整合，雙光子掃描成像結(jié)果顯示小鼠血管侵入移植物并生長延伸，血管內(nèi)血流活躍，移植物類器官功能性血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)展良好^【10】。

Q5：有哪些細(xì)胞因子/小分子可以促使干細(xì)胞向血管分化？

A5：干細(xì)胞在分化過程中，受不同的信號通路調(diào)控。那么激活/抑制特定的通路就要通過添加不同的細(xì)胞因子/小分子來實(shí)現(xiàn)。

下表總結(jié)了血管分化途徑中所需的細(xì)胞因子/小分子，以及在分化過程中行使的功能^【11】。

表1. 血管類器官培養(yǎng)中所需的細(xì)胞因子和小分子^【11】

Q6：血管化后的類器官有哪些可檢測的特征和功能？

A6：

1、具有血管的一些表型特征，如：在含有凝膠的3D培養(yǎng)體系下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以自發(fā)形成血管網(wǎng)絡(luò)；能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞（CD31）、周細(xì)胞（PDGFR-β）、血管基底膜（Col IV）等相應(yīng)的血管特征標(biāo)志物（如圖3）；

圖3. 從人多能干細(xì)胞分化出來的血管網(wǎng)絡(luò)，和血管類器官的特征標(biāo)志物^【12】

2、能夠分泌多種因子，調(diào)節(jié)目的細(xì)胞的發(fā)育成熟，如：與單獨(dú)培養(yǎng)的腦類器官相比，血管化的腦類器官中神經(jīng)元更成熟^【8】；

3、具有一定的可灌注功能，如：向血管化的類器官中灌注FITC-葡聚糖，通過檢測類器官內(nèi)部的FITC信號，確定血管是否具有可灌注的功能^【13】；

4、與未血管化的類器官相比，能夠更好地維持類器官的長時間生長，凋亡信號更低^【14】；

5、與某些類器官共培養(yǎng)時能夠執(zhí)行功能，如：與腦類器官共培養(yǎng)可以形成血腦屏障；

6、在體內(nèi)移植類器官過程中，血管系統(tǒng)可以募集宿主ECs來重建功能性血管系統(tǒng)，并促進(jìn)血液流入移植物，提高移植物的存活率^【8】；

Q7：在類器官血管化的模型中，如何有效地定位血管？

A7：

1、如果需要實(shí)時觀察血管的生成情況，可以將內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)記，在培養(yǎng)過程中可以在熒光顯微鏡下觀察血管結(jié)構(gòu)^【15】；

2、由于內(nèi)皮細(xì)胞在凝膠培養(yǎng)體系中易成管，因此可以在培養(yǎng)過程中使用熒光標(biāo)記的液體灌注，在熒光顯微鏡下可以觀察到清晰的血管結(jié)構(gòu)^【16】；

3、可以將培養(yǎng)物固定后，通過免疫熒光鑒定出血管內(nèi)皮細(xì)胞的位置。

Q8：和單一類器官培養(yǎng)體系相比，類器官-血管這種共培養(yǎng)的體系需要如何調(diào)整？

A8：通常是兩種培養(yǎng)基按照1：1（v/v）混合，便于維持兩種模型的生長。當(dāng)然這并不一定是最優(yōu)的培養(yǎng)體系，如果有需要可以進(jìn)行不同配比和其他體系的優(yōu)化。

Q9：不同組織的血管化模型是一致的嗎？

A9：不是的，由于身體的每個組織都有自己獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成和功能，那么我們構(gòu)建的血管化類器官也要匹配對應(yīng)組織的特性，這些差異主要包括不同的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、內(nèi)皮細(xì)胞表型等特征。例如：肌肉、脂肪或血腦屏障等組織中的ECs可以是“連續(xù)的”，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密地連接在一起，限制了通透性；而在一些內(nèi)分泌組織中，ECs可以是“不連續(xù)的”，細(xì)胞之間有間隙，可以允許更大的分子進(jìn)行交換^【17】。

Q10：可以實(shí)現(xiàn)不同類型的類器官共培養(yǎng)嗎？

A10：已有研究通過將肝臟和胰島類器官進(jìn)行共培養(yǎng)，構(gòu)建了2型糖尿病（T2DM）疾病模型（如圖4）^【18】，這種多類器官系統(tǒng)可以在生理和病理?xiàng)l件下體外模擬肝-胰島軸，為今后 T2DM 發(fā)病機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供了獨(dú)特的研究平臺。

圖4. 在微孔設(shè)備中共培養(yǎng)肝臟和胰島類器官^【18】

Takebe等人利用hPSC的三維分化方法產(chǎn)生多內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)域，在前腸-中腸邊界形成了視黃酸依賴的肝膽胰臟器官結(jié)構(gòu)，在體外實(shí)現(xiàn)了人肝-膽-胰（hepato-biliary-pancreatic, HBP）類器官的共培養(yǎng)^【19】。

圖5. hPSC誘導(dǎo)分化為HBP類器官的原理圖^【19】

近岸蛋白依靠專業(yè)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，精心打造類器官驗(yàn)證平臺，致力于為廣大類器官客戶提供經(jīng)驗(yàn)證、高活性、可信任的類器官培養(yǎng)產(chǎn)品。近岸蛋白可提供自主研發(fā)生產(chǎn)的30余種類器官培養(yǎng)相關(guān)細(xì)胞因子，如Activin A、BMP-4、Wnt3a、R-Spondin、Noggin、EGF、FGFs等高活性、高穩(wěn)定性細(xì)胞因子，以及一系列類器官培養(yǎng)基，涵蓋腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌等腫瘤類器官以及正常肝/肺類器官完全培養(yǎng)基，經(jīng)過類器官培養(yǎng)驗(yàn)證，專為類器官培養(yǎng)開發(fā)，產(chǎn)品適用性高，已廣泛應(yīng)用于企業(yè)和科研院所，讓您的類器官培養(yǎng)更可控!

類器官培養(yǎng)細(xì)胞因子產(chǎn)品

類器官培養(yǎng)基產(chǎn)品

參考文獻(xiàn)

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