編者按
原發(fā)性腦腫瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的一組異質(zhì)性腫瘤，常見的惡性原發(fā)性腦腫瘤患者的治愈率和存活期均較低，其治療手段和治療效果也相當(dāng)有限。因此，需要構(gòu)建合適的腫瘤模型來研究疾病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)、新型抗腫瘤藥物和/或治療方法的臨床前藥效學(xué)和安全性評價。
今天，我們分享2023年由中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心、藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室研究團隊發(fā)表的一項研究進展綜述，該文總結(jié)了原發(fā)性腦腫瘤體內(nèi)和體外模型的研究進展。體外模型主要包括腦腫瘤細胞株培養(yǎng)、類器官培養(yǎng)以及腦切片模型；體內(nèi)模型主要包括嚙齒類動物模型以及其他模式生物如果蠅、斑馬魚。目前已經(jīng)開發(fā)了許多各具優(yōu)缺點的原發(fā)性腦腫瘤疾病模型，但這些模型尚不能完全模擬人體內(nèi)腦腫瘤的復(fù)雜情況，因此研究者們也在現(xiàn)有基礎(chǔ)上不斷開發(fā)更加復(fù)雜的疾病模型，用于研究原發(fā)性腦腫瘤的治療、藥物篩選和評價等。
文章題目
原發(fā)性腦腫瘤的臨床前疾病模型研究進展
雜志：中國新藥雜志
發(fā)表時間：2023年第32卷第8期
作者：梁志遠、黃芝瑛、耿興超、林志、屈哲等
單位：中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心/藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室；中山大學(xué)藥學(xué)院等
01、研究背景
原發(fā)性腦腫瘤是指因中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS)內(nèi)細胞癌變導(dǎo)致的一大類癌癥，含有超過100種組織病理學(xué)上截然不同的子類，每種子類的流行病學(xué)、臨床特征、治療方法以及疾病終點都不盡相同。
最常見的原發(fā)性腦腫瘤是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、聽神經(jīng)瘤、淋巴瘤原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)和原始(髓母細胞瘤)神經(jīng)外肝層腫瘤。根據(jù)WHO于2020年的統(tǒng)計，185個國家原發(fā)性腦腫瘤的發(fā)病率在所有癌癥中僅占1.6%(308102例)。但因為有血腦屏障（Blood-brain barrier, BBB）的存在，化療藥物很難通過循環(huán)系統(tǒng)進入病址，導(dǎo)致對原發(fā)性腦腫瘤的治療收效甚微。一旦被發(fā)現(xiàn)患有腦腫瘤，患者的負擔(dān)會顯著提升，并且腦腫瘤具有較高的致死率。據(jù)報道，在被診斷惠有惡性腦腫瘤的患者中，僅有1/3能夠存活5年以上。
因此，為了延長腦腫瘤患者的存活時間、提高患者生活質(zhì)量，需要對原發(fā)性腦腫瘤進行基礎(chǔ)的生物學(xué)研究以及開發(fā)相應(yīng)的治療手段，而這些研究離不開原發(fā)性腦腫瘤疾病模型的構(gòu)建和開發(fā)。
理想的原發(fā)性腦腫瘤疾病模型應(yīng)具備以下特征：基因背景與人的腦腫瘤相似；腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)與人的腦腫瘤內(nèi)微環(huán)境相似；與人的腦腫瘤具有類似的異質(zhì)性；造模程序標準化且具有重現(xiàn)性；經(jīng)濟實用等。
本綜述將從體外模型、體內(nèi)模型這兩方面闡述原發(fā)性腦腫瘤模型的研究進展，詳細闡述各類原發(fā)性腦腫瘤模型的構(gòu)建方法、應(yīng)用領(lǐng)域以及優(yōu)缺點。
02、研究成果
1. 原發(fā)性腦腫瘤的體外模型
原發(fā)性腦腫瘤的體外模型相較于體內(nèi)模型來說，能夠通過調(diào)整腫瘤的外環(huán)境來探究疾病的分子機制，甚至還可以通過添加免疫細胞來探究TME 的狀況。常見的原發(fā)性腦腫瘤體外模型有腦腫瘤細胞株培養(yǎng)、3D類器官培養(yǎng)以及器官型腦切片培養(yǎng)型等。
1. 1 腦腫瘤細胞株模型
腦腫瘤細胞株培養(yǎng)的原發(fā)性腦腫瘤模型不常用，其通常是培養(yǎng)單層的腫瘤細胞，如大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞、大鼠膠質(zhì)肉瘤9L細胞、人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤U-87 MG、人源的原發(fā)性腦腫瘤細胞等，通常用來探究腦腫瘤內(nèi)的分子變化、原發(fā)性腦腫瘤細胞的遷移能力、用于組織病理學(xué)鑒定和免疫細胞化學(xué)分析等。
而為了進一步探究TME的作用，可以在培養(yǎng)其他神經(jīng)細胞時直接加入腫瘤細胞或使用培養(yǎng)腫瘤細胞的Transwell小室等方法來進行探究。腦腫瘤細胞株模型操作簡便并且相當(dāng)經(jīng)濟，但是卻不能展現(xiàn)出完整的病理進程及TME在其中的作用，因此需要研究功能較為完善的模型來進行臨床前研究。
1. 2 類器官培養(yǎng)模型
類器官培養(yǎng)模型相較于腦腫瘤細胞株模型而言，其特征更加接近機體的病生理環(huán)境。從比較簡單的原發(fā)性腦腫瘤細胞成球，到比較前沿的原發(fā)性腦腫瘤類器官模型，跨度較大，包含的特點也從簡單到復(fù)雜。
較為簡單的原發(fā)性腦腫瘤類器官模型，通過使用懸滴法等培養(yǎng)方法，將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞等腦腫瘤細胞培養(yǎng)成球，得到類器官模型，其異質(zhì)性與實際上的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤相似，并且在組織病理學(xué)上具有類似的細胞分布、缺氧核心及梯度分布的細胞代謝物。這種簡單的類器官模型，可以作為體外的疾病模型或用于藥物篩選。
而為了進一步體現(xiàn)TME的復(fù)雜性，研究人員在成球階段使用含有巨噬細胞以及腦腫瘤細胞的細胞混懸液或使用含有神經(jīng)小膠質(zhì)細胞及腦腫瘤細胞的細胞混懸液，來探究多種細胞之間的相互作用。通過這些研究，發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞在共同成球后，會分泌出白介索-10 (interleukin 10，IL-10)和表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF)，提高耗氧量，甚至產(chǎn)生對紫杉醇的抗藥性；也發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞在與腦腫瘤細胞成球后，會展現(xiàn)出一定的對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的細胞毒性。
還有用于研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的模型，研究者分離出腦腫瘤患者的細胞，并將其轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells），并在體外培養(yǎng)成大腦類器官后，再加入惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)，最終使用細胞成像技術(shù)來研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力。
而iPSC的使用也給相關(guān)研究帶來想象空間，iPSC成為類大腦類器官后，可以選擇加入巨噬細胞(之后會進一步轉(zhuǎn)化為神經(jīng)小膠質(zhì)細胞)，隨后再加入患者的腫瘤干細胞和免疫細胞，從而使得整個環(huán)境更加接近機體的病生理狀態(tài)。當(dāng)然，到目前為止這種類器官模型也不能完全模擬真實情況下的TME情況，也排除了BBB對TME的影響，且技術(shù)上較為復(fù)雜。
1. 3 腦切片模型
腦切片模型較好地保留了腦組織的細胞結(jié)構(gòu)，并且易于在培養(yǎng)皿上操作和觀察。目前，腦切片模型的來源更多的是嚙齒類動物，近些年來，也會更多地使用轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物。
此外，還可以向腦切片模型中添加神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞或原發(fā)性腦腫瘤細胞的球，通過觀察神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的行為以及其與腦組織細胞的相互作用，探索腫瘤細胞在腦內(nèi)遷移的機制，甚至可以將腫瘤細胞注射至特定的腦區(qū)，用以研究特定腦區(qū)的腫瘤病變。
另外，因為一個實驗動物的大腦可以制作多個切片來研究不同的病變，腦切片模型還可以減少實驗動物的使用。但是，該模型也并不是完美的，一般來說，腦切片模型在體外只能存活3周左右，不利于對進程較慢的原發(fā)性腦腫瘤的研究和長期用藥的研究。此外，雖然保留了血管，但是由于其內(nèi)部液體不流通，對免疫細胞募集到病變處有一定影響。
最后，因為需要將大腦切片，不可避免地誘發(fā)細胞死亡以及激活神經(jīng)小膠質(zhì)細胞導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生，但可以通過使用腦切片內(nèi)深處的細胞以避免炎癥等導(dǎo)致的影響。
2. 原發(fā)性腦腫瘤的體內(nèi)疾病模型
原發(fā)性腦腫瘤的體內(nèi)疾病模型種類多樣、各有優(yōu)劣，其中最主要應(yīng)用的是嚙齒類動物模型。隨著時間的推移，也開發(fā)出了新的模式動物，如果蠅和斑馬魚。
2. 1 原發(fā)性腦腫瘤的嚙齒類動物模型
原發(fā)性腦腫瘤的嚙齒類動物模型的種類繁多，但是大致可以分為同種異體原位移植模型、異種異體原位移植模型以及基因改造小鼠模型。
2.1.1 同種異體原位移植模型
同種異體原位移植模型，即將跟實驗動物同種的腦腫瘤細胞株，通過立體定位手術(shù)轉(zhuǎn)移至相應(yīng)動物顱內(nèi)形成的原發(fā)性腦腫瘤模型。常用的腦腫瘤細胞株有大鼠C6 神經(jīng)膠質(zhì)宿細胞株、大鼠9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤細胞株、大鼠F98神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株、小鼠 GL261神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株等。這些細胞能夠在相應(yīng)實驗動物大腦內(nèi)的第四腦室、小腦或其他區(qū)域生長成瘤，形成研究者需要的原發(fā)性腦腫瘤模型。
這種構(gòu)造模型辦法的最大好處是實驗動物具有完整的免疫能力，這對免疫治療藥物的評價非常重要。有研究通過RNA測序以及質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（Mass Cytometry，CyTOF）來快速確認不同小鼠惡性膠質(zhì)瘤細胞株同種異體原位移植模型形成的惡性膠質(zhì)瘤對免疫系統(tǒng)的反應(yīng)強弱，能更好地選擇用于惡性膠質(zhì)瘤的免疫療法的模型個體。除此以外，同種異體原位移植模型也能提供一些候選藥物和療法的相關(guān)信息。
有研究者使用大鼠F98神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株造的神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型，證明了神經(jīng)干細胞和間充質(zhì)干細胞能夠作為基因治療藥物的載體，具有一定開發(fā)成治療腦腫瘤的療法的潛力。但是這種模型也有一定的缺陷：腫瘤細胞株會因為多次傳代導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳偏移；同種異體原位移植模型缺乏實際腦腫瘤中逐步基因變化；有時候造特定模型時會因為腦腫瘤細胞沒有進入腦實質(zhì)而導(dǎo)致造模失敗；其基因背景與人有差異。
2.1.2 異種異體原位移植模型
異種異體原位移植模型，即將人的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞通過立體定位手術(shù)，轉(zhuǎn)移至免疫抑制的嚙齒類動物(如裸鼠)顱內(nèi)而制造的模型。最常用的幾種細胞分別是人腦星型母膠質(zhì)細胞瘤U87、人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U251等，但是長期培養(yǎng)的細胞株會有基因偏移的現(xiàn)象，故也有研究者使用的是患者的腦腫瘤細胞。
這種模型在一定程度上能夠具有血管再生和腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，但是也只維持了原發(fā)性腦腫瘤的部分組織病理學(xué)特性異質(zhì)性和分子生物學(xué)特性。并且，由于使用的是免疫缺陷的動物，必須考慮這對腫瘤的免疫環(huán)境以及TME產(chǎn)生的影響。以裸鼠為例，裸鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細胞，只能產(chǎn)生骨髓細胞(包括神經(jīng)小膠質(zhì)細胞)，因此就缺乏了獲得性免疫這一部分對原發(fā)性腦腫瘤的影響。而這也影響到了這種模型在藥物研究方面的應(yīng)用。
針對這樣的缺陷，有研究者構(gòu)建出人源化模型鼠。一般來說，構(gòu)建模型鼠有3種：移植人外周血單核細胞(human Peripheral blood mononuclear cell，hu-PBMC)的具有高活性的T維胞，但是移植4~6周后會攻擊宿主且其他免疫細胞功能不健全；移植人CD34造血干細胞則能夠產(chǎn)生所有造血譜系的細胞；骨髓肝胸腺(bone marrow liver thymic，BLT)小鼠，就是將人胚胎的胸腺、肝臟和CD34細胞移植到目標小鼠內(nèi)產(chǎn)生的模型，這種模型的免疫功能最為健全，但最終也會發(fā)生移植物抗宿主病。近些年發(fā)展出了能夠表達人細胞因子的轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠支持人源化小鼠構(gòu)建更加完善的免疫系統(tǒng)，并延遲移植物抗宿主病的發(fā)生。
2.1.3 基因改造鼠模型
原發(fā)性腦腫瘤的另外一種模型即基因改造鼠模型，在使腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因發(fā)生突變后，這種模型的顱內(nèi)就會自發(fā)地發(fā)生病變，生成腫瘤。這種模型在一定程度上具有跟人相似的組織病理學(xué)特性和分子特征，并且其腫瘤能夠逐步具有轉(zhuǎn)移能力。根據(jù)不同的目的，可對不同的基因進行操控。
常見的模型如下：對Rtk基因、H3f3a基因、Hist1h3b基因、P53基因、Rb基因、Nf1基因以及跟細胞周期有關(guān)的基因等的1個或多個進行調(diào)控，可構(gòu)造神經(jīng)膠質(zhì)瘤的模型；對P53基因和c-Myc基因共同調(diào)控，可構(gòu)造脈絡(luò)縱腫瘤；對ptch1基因、P53基因等進行調(diào)控，可以構(gòu)造成神經(jīng)管細胞瘤模型四；對Nf2基因、Cdkn2ab基因、Pdgf基因的1個或多個進行調(diào)控，可以構(gòu)造腦膜瘤模型；對 P53基因和Rb基因共同調(diào)控，可以構(gòu)造松果體母細胞瘤。
而隨著時間發(fā)展，研究者已經(jīng)能夠通過調(diào)控基因表達來構(gòu)建適合研究目的的基因改造小鼠模型，常見的方法有RCAS-tVA和Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)。RCAS-tVA使用的是鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒(replication competent avian-like sarcoma virus，RCAS)以及其鳥類腫瘤病毒 A(tumor virus receptor-A，tVA)，使用這種方法可以將腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)入到表達tVA細胞內(nèi)，一旦控制tVA的基因開始表達，RCAS識別后就會將相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到目標細胞中。
Connolly 等將大鼠的Nestin基因作為調(diào)控tVA表達的開關(guān)，并向大鼠注入攜帶血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和P53的短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)的RCAS，抑制了P53的同時使PDGF過表達，導(dǎo)致大鼠發(fā)生惡性膠質(zhì)瘤；Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)利用了Cre重組酶的特性，能夠識別 LoxP位點，將目標基因嵌入同向的LoxP位點時，也會使其成環(huán)斷開，從而切除LoxP 位點之間基因。Han等利用該技術(shù)在小鼠胚胎期時敲除了Smarcb1基因，構(gòu)造出了各方面與人類相似的非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤模型。
該模型也存在缺陷，首先是進行轉(zhuǎn)基因改造的成本以及耗時都較大，其次是因為種類不同，構(gòu)建的模型的腦腫瘤異質(zhì)性、分子生物學(xué)特征等與人類有一定的差異。
2.2 其他原發(fā)性腦腫瘤體內(nèi)模型
原發(fā)性腦腫瘤的嚙齒類動物模型需要大量的資源以及時間投入，不利于使用高通量的方法來篩選藥物，因此在該方面需要尋求另外的替代模型。而這時候，簡單且基因更加可控的動物，如斑馬魚和果蠅便是較為理想的目標。
2.2.1 斑馬魚
斑馬魚是目前常用的實驗動物之一，其與人類基因有87%的相似性,并且82%的人類疾病基因都能在斑馬魚上找到對應(yīng)。此外，斑馬魚的呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似且其基因操控相對便捷，十分適合用于原發(fā)性腦鐘瘤的研究。
斑馬魚具有一個特性，其胚胎以及幼蟲時均是透明的，可以實時觀察腫瘤細胞滲透以及TME的情況。此外，斑馬魚的BBB在卵子受精后發(fā)育的d15才會成熟，這就意味著研究人員可以根據(jù)他們的研究目的來選擇給藥的時間，用于研究BBB成熟或不成熟下藥物對腦腫瘤的治療效果。
獲得斑馬魚原發(fā)性腦腫瘤模型的方法一般有基因改造、移植這2種辦法。Jung 等通過對Ptf1基因的調(diào)控來激活蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)，從而構(gòu)造了位置在小腦的神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型。此外，Ju等通過控制斑馬魚Gfap和Krt5基因的表達，構(gòu)造出了神經(jīng)鞘瘤模型。因為透明的特性，移植這一辦法變得簡單且高效，并且可以時刻觀測腫瘤細胞的移植、生長以及轉(zhuǎn)移等過程。Eden等將紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入到小鼠神經(jīng)干細胞中，并將該細胞移植至斑馬魚幼蟲內(nèi)，產(chǎn)生的腦腫瘤具有主要的分子生物學(xué)特點以及組織病理學(xué)特點，并且可以通過紅色熒光蛋白觀察其轉(zhuǎn)移。通過相同的辦法，還可以構(gòu)造出惡性膠質(zhì)瘤模型、室管膜瘤模型以及脈絡(luò)縱腫瘤模型。
2.2.2 果蠅
果蠅在遺傳方面的研究中發(fā)揮著重要作用，在基因組上與人類十分相似，75%的人類疾病基因與果蠅同源，是構(gòu)建人類疾病模型較為理想的動物，并且其生命周期只有10d，大大降低時間成本。
果蠅可以作為原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型。果蠅的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)與人類高度同源。Read 等同時激活PI3K 和EGFR的表達，使得果蠅的神經(jīng)膠質(zhì)細胞癌變，產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤。果蠅也可用于研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移，Witte等通過上調(diào)胰島素受體基因Pvr、Htl以及EGFR基因，得到了具有遷移性的果蠅神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型。
總之，無論體外模型還是體內(nèi)模型都試圖更加接近人體原發(fā)性腦腫瘤的病生理狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出經(jīng)濟的、操作程序可控的、可長期培養(yǎng)/使用的實驗?zāi)Ｐ椭陵P(guān)重要，在這些模型的基礎(chǔ)上，研究人員也揭示了原發(fā)性神經(jīng)腫瘤的一些特異性靶點，并且研發(fā)出相應(yīng)的治療策略。然而，至今已應(yīng)用的原發(fā)性腦腫瘤模型各具優(yōu)缺點，見表1。因此，需要根據(jù)藥物性質(zhì)特征/不同靶點通路選擇更加合適的疾病模型或模型組合、模型改造來更加全面、可靠的評價藥物。
表1 各原發(fā)性腦腫瘤模型的優(yōu)缺點
03、編者點評
目前，原發(fā)性腦腫瘤的體內(nèi)以及體外模型已經(jīng)揭示了在原發(fā)性腦腫瘤發(fā)病的過程中，細胞內(nèi)的一系列分子生物學(xué)變化，這對于原發(fā)性腦腫瘤的治療來說無疑是一筆巨大的財富。在前期研究的基礎(chǔ)上，相關(guān)的藥物也陸續(xù)被研發(fā)并處于臨床階段或上市，靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)線粒體異檸檬酸脫氫酶（Mitochondrial isocitrate dehydrogenase，IDH）突變的恩西地平和艾伏尼布、靶向惡性膠質(zhì)瘤檢查點的納武利尤單抗(NCT02667587)、使用基因改造的神經(jīng)干細胞治療惡性膠質(zhì)瘤(NCT02192359)等。
根據(jù)這些模型得到的分子生物學(xué)信息，利用計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design,CADD)的方法，如分子動力學(xué)模擬、分子對接、定量構(gòu)效關(guān)系等技術(shù)，來對一系列化合物進行虛擬篩選，最終得到能夠通過BBB且具有一定效果的理想藥物。
為了緊跟各類新型的治療原發(fā)性腦腫瘤藥物研發(fā)的腳步，研究者們?nèi)孕璨粩喙タ烁黝愒l(fā)性腦腫瘤體內(nèi)外模型的缺陷，例如模型內(nèi)原發(fā)性腦腫瘤的細胞異質(zhì)性不如實際豐富、模型的TME環(huán)境與人類實際的TME環(huán)境有差別等，開發(fā)出更加完善的原發(fā)性腦腫瘤疾病模型，為臨床前藥效評價以及安全評價提供有效的研究模型。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實驗室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！