腫瘤異質(zhì)性是癌癥進(jìn)展和治療抵抗的主要驅(qū)動(dòng)因素之一。據(jù)推測，癌細(xì)胞亞群之間的合作對于維持異質(zhì)性和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要。然而，這種合作如何發(fā)生仍然難以捉摸。
細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞間通訊的中心介質(zhì)。癌癥EVs具有很多功能，如促進(jìn)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的分化，增強(qiáng)血管生成，調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答，建立轉(zhuǎn)移前生態(tài)位并賦予非轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等特性。然而，具有不同表型和腫瘤形成能力的癌細(xì)胞亞群之間EVs的交換與交流的問題尚未得到解決。
2022年1月來自葡萄牙波爾圖大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Gut（IF=23.059）上發(fā)表了題為“Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumour progression”的文章，首次揭示了由胰腺癌干細(xì)胞（CSC）細(xì)胞外囊泡領(lǐng)導(dǎo)的有組織的通信網(wǎng)絡(luò)，并展示了其在腫瘤生物學(xué)中的重要性。再通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)CSC中特異性表達(dá)的agrin，通過agrin/LRP-4/YAP通路影響腫瘤進(jìn)展，并證明了agrin可作為胰腺癌治療干預(yù)的潛在新靶點(diǎn)，也可用于預(yù)測胰腺癌預(yù)后。
研究材料
人胰腺癌細(xì)胞；胰腺導(dǎo)管腺癌原位模型；患者衍生的異種移植物模型；基因工程小鼠模型；PDAC患者的血清樣本
技術(shù)路線
· 步驟1：構(gòu)建熒光標(biāo)記EVs的克隆，研究細(xì)胞亞群之間EVs的流動(dòng)；
· 步驟2：改變微環(huán)境，研究EVNet的變化；
· 步驟3：構(gòu)建動(dòng)物模型，抑制EVs形成，研究破壞EVNet對腫瘤進(jìn)展的影響；
· 步驟4：構(gòu)建模型，比較CSC和NSCC分泌的EVs對腫瘤進(jìn)展的影響；
· 步驟5：通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究CSC EVs影響腫瘤進(jìn)展的原因；
· 步驟6：驗(yàn)證agrin可作為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)；
· 步驟7：發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證循環(huán)agrin陽性EVs是疾病進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物。
研究結(jié)果
1. 細(xì)胞外囊泡在癌細(xì)胞亞群之間自發(fā)流動(dòng)
首先，研究人員在人胰腺癌細(xì)胞中建立了四種不同熒光標(biāo)記EVs的穩(wěn)定克隆，又基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，從每種克隆中分別分選出一種特定的細(xì)胞亞群，兩種是以胰腺癌干細(xì)胞（CSC，與PADC的不良預(yù)后相關(guān)）為特征的罕見亞群，CD133+細(xì)胞和CD24+CD44+細(xì)胞；另外兩種是占據(jù)大多數(shù)的非干細(xì)胞（NSCC）亞群，CD24?CD44+細(xì)胞和4N (CD133?CD24?CD44?EpCAM?)細(xì)胞。將這四種細(xì)胞亞群混合培養(yǎng)，通過共聚焦成像分析研究EVs在細(xì)胞亞群之間的流動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，69.56%±11.92%的細(xì)胞對其他亞群的EVs呈陽性，表明癌癥EVs在它們之間自發(fā)流動(dòng)，且流動(dòng)方向以干細(xì)胞（CSC）到非干細(xì)胞（NSCC）為主，并排除了分泌的EVs數(shù)量、降解速率或細(xì)胞亞群的內(nèi)吞能力的影響。綜上，胰腺癌細(xì)胞亞群通過細(xì)胞外囊泡的自發(fā)流動(dòng)，構(gòu)建了一個(gè)有組織的細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)（EVNet）。
圖1 PDAC癌細(xì)胞亞群之間EVs的流動(dòng)
2. EVNet有助于癌細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境
接下來，研究人員探討了改變微環(huán)境的情況下EVNet是否受到影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧使得細(xì)胞間的通訊頻率顯著增加，EVs流動(dòng)方向仍以 （CSC）到（NSCC）為主。而化療引起EVs流動(dòng)方向改變，非干細(xì)胞亞群之間的通訊頻率顯著增加。這表明EVNet是具有可塑性的，在面對微環(huán)境的挑戰(zhàn)時(shí)，會(huì)改變通訊速度甚至路線。
Rab27a參與細(xì)胞外囊泡的形成，敲除Rab27a后，細(xì)胞外囊泡分泌減少，缺氧和化療讓胰腺癌細(xì)胞死亡比例顯著升高。因此，細(xì)胞外囊泡通訊有助于癌細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境變化。
圖2 微環(huán)境改變對EVNet的影響
3. 破壞EVNet會(huì)阻礙腫瘤生長
為了進(jìn)一步研究EVNet的生物學(xué)作用，研究人員構(gòu)建了Rab27a功能缺失型胰腺癌鼠模型，發(fā)現(xiàn)通過多四環(huán)素治療的小鼠腫瘤生長減緩，肝臟大轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著減少，但組織學(xué)上沒有差異。接下來，用Rab27a的特異性小分子抑制劑Nexinhib20處理兩種動(dòng)物模型（KPC、PDXs），來抑制EVs的分泌。結(jié)果顯示Nexinhib20處理后，KPC存活率顯著提高，PDXs腫瘤生長減緩。綜合表明Rab27a敲低會(huì)損害EVs介導(dǎo)的通訊，從而阻止癌癥的進(jìn)展。
圖3 EVNet對腫瘤生長的影響
4. CSC分泌的 EVs是影響PDAC進(jìn)展的原因
由于EVNet中最常見的通訊路徑是從CSC到NSCC，故特異性地去抑制CSC的EVs的通訊作用，從而研究其在生物學(xué)中的作用。首先從Rab27a敲低組和對照組中分別分離出CSC和NSCC細(xì)胞亞群，交叉混合后再原位移植到小鼠中，構(gòu)建Rab27a敲低的CSC小鼠模型和NSCC小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，Rab27a敲低的CSC小鼠模型中，多四環(huán)素喂養(yǎng)的小鼠腫瘤生長緩慢，重量顯著降低；而Rab27a敲低的NSCC小鼠模型中，無顯著變化。表明敲低CSC中的Rab27a，抑制其通訊能力，才是影響腫瘤生長的原因。
圖4 CSC和NSCC通訊功能差異比較
5. CSC EVs具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成并且富含agrin，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
為了找到CSC EVs如此特別的原因，研究人員采用labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)對四種人PDAC細(xì)胞系的癌細(xì)胞亞群及其分泌的EVs分別進(jìn)行檢測。通過一系列生物信息學(xué)比較分析細(xì)胞和外泌體，CSC和NSCC之間的蛋白表達(dá)及功能差異，發(fā)現(xiàn)CSC EVs和NSCC EVs的蛋白質(zhì)組成有非常大的差異，僅在CSC EVs中檢測到的大量蛋白質(zhì)與PDAC發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，例如軸突導(dǎo)向通路，其中agrin是最富集的蛋白質(zhì)之一。
在肝癌中，agrin通過與LRP-4受體結(jié)合激活YAP轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)肝癌發(fā)生。研究人員在胰腺癌細(xì)胞中也驗(yàn)證了此通路的存在，證明了CSC EVs中的agrin促進(jìn)YAP活化，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活率。
圖5 CSC和NSCC EVs蛋白質(zhì)表達(dá)及功能比較
6. Agrin是PDAC中CSC的潛在治療靶點(diǎn)
上文已經(jīng)證明了敲低Rab27a來抑制CSC中EVs的分泌可以抑制腫瘤生長，接下來，研究人員又試圖評(píng)估CSC EVs中特異性表達(dá)的agrin下調(diào)是否會(huì)對疾病進(jìn)展產(chǎn)生影響。先從agrin敲低和對照組的細(xì)胞中分離出CSC和NSCC，再交叉混合移植到小鼠中，研究發(fā)現(xiàn)CSC中agrin下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長減慢，腫瘤體積減小。在構(gòu)建的agrin敲低的KPC模型（KPAC）中，與KPC小鼠相比，顯示出延遲的疾病進(jìn)展，同時(shí)YAP表達(dá)顯著下調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)證明了agrin是胰腺癌治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。
圖6 阻斷agrin的表達(dá)對疾病進(jìn)展的影響
7. 循環(huán)agrin陽性EVs是疾病進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物
最后，研究人員收集了44名胰腺癌患者的110例血液樣本，通過成像流式細(xì)胞術(shù)鑒定EV中agrin的表達(dá)，證明了cAGRN+EV的百分比與腫瘤負(fù)荷呈正比；其次發(fā)現(xiàn)了cAGRN+EVs和cCD133+EVs（來源于CSC）的百分比之間有顯著的相關(guān)性，進(jìn)一步證明了cAGRN+EVs的來源；最重要的是，在沒有手術(shù)的患者中，cAGRN+EVs每增加1%，使疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)增加2.94倍。
又通過受試者特征曲線（ROC）分析研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)agrin陽性EVs可作為未接受手術(shù)的患者疾病進(jìn)展的特異性和敏感性的生物標(biāo)志物，與cCD133+EVs組合會(huì)提高預(yù)測疾病進(jìn)展的準(zhǔn)確性。
圖7 疾病進(jìn)程中循環(huán)agrin陽性EVs的變化
小編小結(jié)
腫瘤是不同癌細(xì)胞亞群組成的復(fù)雜實(shí)體。癌細(xì)胞亞群之間會(huì)通過EVs進(jìn)行通訊交流，且這種通信對于癌細(xì)胞克服微環(huán)境變化和茁壯成長至關(guān)重要。本文的工作表明，胰腺癌細(xì)胞亞群通過富含agrin的CSC EVs建立了一個(gè)有組織的，具有可塑性的通信網(wǎng)絡(luò)EVNet。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了agrin可作為胰腺癌治療干預(yù)的潛在新靶點(diǎn)，并在PDAC臨床樣本中，證實(shí)了cAGRN+EV是疾病進(jìn)展的預(yù)后生物標(biāo)志物，具有深遠(yuǎn)的臨床意義。
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